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目的:
以Basal-like型乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231为研究对象,观察黄芪及其成分对乳腺癌细胞增殖和凋亡,以及phospho-Akt蛋白水平的影响,并比较黄芪成分黄芪甲苷和芒柄花素单用与联合应用之间的差异;再通过观察黄芪及其成分对Basal-like型乳腺癌细胞Akt磷酸化相关的抑癌因子的基因和蛋白水平的影响,来进一步探讨黄芪及其成分影响乳腺癌细胞增殖和phospho-Akt水平的机制。为中医药临床治疗Basal-like型乳腺癌提供新的实验依据。
方法：
用黄芪注射液(Astragalus injection,AI)、芒柄花素(Formononetin,F)、黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AⅣ)和黄芪甲苷+芒柄花素(AⅣ与F比例为1∶4,Formononetinplus AstragalosideⅣ,AⅣ+F)以及西药顺铂对照(Cisplatin,Cis)干预Basal-like型乳腺癌细胞株MDA-MB-468和MDA-MB-231,相差显微倒置荧光显微镜和HE染色观察细胞形态的变化,MTT法和流式细胞术观察黄芪及其成分对Basal-like型乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231增殖和凋亡的影响;Real-time PCR检测Akt2、PTEN、SHIP、PP2A和PHLPP基因水平的变化;In-cell-western方法检测p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、PTEN、SHIP和PP2A蛋白水平的变化;Western blot检测细胞内和细胞膜上总Akt蛋白的表达,确定黄芪及其成分影响p-Akt(Thr308)水平的靶点;采用siRNA干扰技术沉默PP2A基因,确定黄芪及其成分p-Akt(Ser473)水平的靶点。
结果：
与阴性对照组相比,MTT检测发现黄芪及其成分对MDA-MB-468细胞和MDA-MB-231细胞均有较明显的抑制增殖的作用,且结果基本一致。其中以AⅣ+F组抑制作用最强,但与西药对照Cisplatin组无统计学差异(＞0.05),其次为F组、AⅠ组和AⅣ组,差异有统计学意义(p＜0.05)。
Real-time PCR检测发现各干预组对MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞Akt2基因水平无明显影响(p＞0.05)。但对PTEN、SHIP1、PP2A和PHLPP都有不同程度的上调,且较西药顺铂对照组明显(p＜0.05)。除Cisplatin组外,其余各组的MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的PTEN基因都出现了上调,且都以F组最为明显;仅有AⅣ+F组和AⅠ组能同时上调MDA-MB-468细胞和MDA-MB-231.细胞的SHIP1基因;黄芪及其成分各组均能上调两种细胞株的PP2A基因水平,且均以AN+F组最为明显(p＜0.05)。AⅣ+F组、AⅣ组和AⅠ组都能上调两种细胞PHLPP基因的表达,以AⅣ+F组上调幅度最大(p＜0.05)。Cis组仅有MDA-MB-468细胞的PHLPP基因上调(p＜0.05)。西药对照顺铂组对各抑癌基因上调不明显,甚至下调MDA-MB-468的PP2A和SHIP1基因水平(p＜0.05),以及MDA-MB-231细胞的PTEN和SHIP1基因水平(p＜0.05)。
In-cell-western检测发现黄芪及其成分均能下调MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的p-Akt(Thr308)蛋白水平,其中均以AⅣ+F组下调最为明显(p＜0.05);同时,也能下调p-Akt(Ser473)蛋白水平,但AⅣ+F组下调MDA-MB-468细胞p-Akt(Ser473)最为明显(p＜0.05),而对MDA-MB-231细胞的调节,AⅠ组、F组和AⅣ+F组无明显差别(p＞0.05)。
各组药物干预MDA-MB-468细胞2天后,In-cell-western检测发现F组PTEN蛋白的上调最为明显(p＜0.05)。其次为AⅠ组、AⅣ+F组、AⅣ组。而Cis组出现明显下调(p＜0.05)。但仅有AⅣ+F组能上调SHIP1蛋白水平的上调。对PP2A蛋白表达的上调作用却以AⅠ组最为明显(p＜0.05),其次为AⅣ组、AⅣ+F组和F组(后两组间比较无明显差异,p＞0.05)。Cis组无明显上调(p＞0.05)。
AN+F组对MDA-MB-231细胞PTEN蛋白水平的上调作用最为明显(p＜0.05),其次为F组、AⅠ组和AⅣ组。Cis组出现明显下调(p＜0.05)。而各组药物对MDA-MB-231细胞SHIP1蛋白水平无明显影响,但黄芪及其成分对PP2A蛋白表达都有不同程度的上调作用,AⅣ组上调更为明显,其次为AⅠ组和AⅣ+F组(两组间无明显差异,p＞0.05),最后为F组。Cis组PP2A蛋白水平与阴性对照组相比无统计学差异(p＞0.05)。
采用western blot检测细胞总Akt蛋白和细胞膜Akt蛋白的表达水平,发现MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞各药物干预组总Akt蛋白水平与阴性对照组无明显变化,但AⅠ组、F组和AⅣ+F组细胞膜上Akt蛋白水平的表达出现了不同程度的下调(p＜0.05);siRNA干扰技术沉默PP2A基因后,发现黄芪及其成分对MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞增殖的抑制明显减弱,对p-Akt(Ser473)的下调作用也不如沉默之前,尤其以AⅣ组最为明显。
结论：
黄芪及其成分对Basal-like型乳腺癌细胞株MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖都有不同程度的抑制作用,且随时间推移其作用持续。黄芪及其成分通过上调PTEN和SHIP1基因和蛋白水平而抑制p-Akt(Thr308)蛋白的表达,再通过上调PP2A和PHLPP基因和PP2A蛋白水平而下调p-Akt(Ser473)蛋白水平。这可能是其抑制Akt磷酸化的主要机制。芒柄花素主要通过上调PTEN和PP2A基因和蛋白水平抑制Akt的磷酸化,而黄芪甲苷则是主要通过上调PP2A和PHLPP基因表达,以及PP2A蛋白水平来抑制Akt磷酸化,当黄芪甲苷和芒柄花素以1∶4的比例合用时,对细胞增殖的抑制作用最强,且能对Akt磷酸化相关的多个抑癌因子靶点产生影响,因此当黄芪甲苷和芒柄花素为最佳配比时,能发挥最佳效应,这可能是因为两者间能产生较佳的协同作用有关,这将有待于进一步研究。