实验目的：　　 组织工程学是应用生物学和工程学的原理研究开发能够修复、重建或改善病损组织形态和功能的生物替代物的一门学科。目前，应用组织工程方法已经制备出人工骨、软骨、皮肤、肌腱、血管甚至人工胰、人工肝等。我国骨组织工程研究进展较快，已经利用组织工程化骨修复颅骨缺损获得成功。骨再生的形状与数量与骨膜下空间有关，是骨组织再生的重要问题之一。此外，在骨组织工程研究中还存在许多难题，理想的细胞外基质材料的选择和制备是骨组织工程中十分重要的任务，也是组织工程化骨组织能否应用于临床的重要影响因素。　　 理想的骨组织工程细胞外基质材料应具备:1.良好的生物相容性:除无毒、不致畸和致癌之外，还要有利于种子细胞的黏附、增殖和降解产物能及时排除，利于种子细胞的融合生长，无炎症反应，不抑制细胞的生长和分化。2.良好的生物降解性:基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相匹配，降解时间应能根据组织生长特性可以进行人工调控。3.具有三维立体多孔结构:基质材料可加工成三维立体结构，孔隙率最好达90％以上，具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞黏附，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出和细胞的生长。4.可塑性和机械强度:基质材料应具有良好的可塑性，可预先制作成一定形状，并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并能保持一定长度的时间，直至新生组织具有自身生物力学特性。5.良好的材料-细胞界面:材料应能提供良好的材料细胞融合作用界面，利于细胞黏附、生长，更重要的是材料应能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞的表型表达。　　 人工合成高分子材料具有良好的可降解吸收性，同时其组成和结构、机械性能以及材料的降解时间等都能预先设计和调控，因此是组织工程材料中研究最多、应用最广的支架材料。PHBV生物可降解高分子材料的应用是生物医学工程材料的重大进展。因其具备良好的生物相容性、完全的生物可降解性、稳定的压电特性，目前研究已证明PHBV可用于药物缓释载体、组织工程支架材料、构建心脏生物瓣膜、引导膜再生骨和手术缝合线等。　　 但是PHBV的脆性仍然很大，原因在于它的纯度较高，球晶尺寸较大。对于PHBV来说，当HV摩尔含量较低时(≤0.12)，它的断裂伸长率只有6％左右，在拉伸条件下能成晶和流动。由于PHB和PHBV的高纯度，结晶成核密度比较低，室温下能够二次结晶，结晶度比较高，结晶速度比较慢易生成大尺寸的球晶。以球晶中心向外扩展形成许多圆环状的开裂以及沿球晶生长方向形成许多劈裂，从而导致了PHBV呈脆性断裂。另外，PHBV的机械性能差，骨结合力弱更是需要解决的问题。进一步提高PHBV共聚物的生物相容性并增强其耐腐蚀性能，使其能够作为骨损伤后的固定材料和骨组织工程的支架材料，是本实验研究的主要问题。　　 通过探索溶解在PHBV中的不同浓度的3-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸对于骨髓间充质干细胞的生长增殖作用，制备出具有最佳浓度的3-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸PHBV，构建成具有立体化的三维组织工程支架，在体外将其与骨髓间充质干细胞进行共培养，检测骨髓间充质干细胞的形态变化、细胞活力、细胞周期等各项指标，以探讨表面改性的PHBV膜与骨髓间充质干细胞融合的新型人造膜状组织替代物的可行性。为临床应用提供实验依据。　　 实验方法：　　 SPF级健康成年SD大鼠(100-120g)，颈椎离断处死，全骨髓培养法分离出均质的骨髓间充质干细胞。将第三代细胞离心，流式细胞仪检测细胞表面cd34、cd44、cd90、cd11b抗原并进行鉴定。PHBV与甲苯搅拌均匀，用注射器抽取成膜液注入直径9cm的玻璃培养皿，真空干燥机室温下干燥成厚度为0.5mm的薄膜。将其分为4组，分别是:0％阿魏酸处理组、5％阿魏酸处理组、10％阿魏酸处理组、15％阿魏酸处理组。将骨髓间充质干细胞与改性的PHBV膜复合培养，用扫描电镜观察材料表面细胞的微细结构形态变化。制备浸提液，用浸提液培养骨髓间充质干细胞，用倒置显微镜观察细胞生长状态、细胞活力检测（MTT法）、细胞周期检测等多种方法，综合分析骨髓间充质干细胞与经阿魏酸处理的PHBV膜的体外组织相容性。　　 实验结果：　　 经过原代培养5d后，骨髓间充质干细胞融合成单层。倒置显微镜观察，见骨髓间充质干细胞呈梭形贴壁生长，大小均匀，大量生长时细胞排列呈漩涡状。接触抑制现象不明显，呈现出常见的骨髓间充质干细胞特征。流式细胞仪表型分析结果，所获得的BMSCs均质性好，低表达淋巴细胞表面标志CD11b、造血干细胞表面标志CD34;高表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90。　　 扫描电镜观察可见:PHBV膜的材料表面结构平整，有利于细胞生长。分别与骨髓间充质干细胞复合培养6h、12h、24h后，在各组材料表面均有细胞黏附，细胞呈梭形或多角形，伸出伪足黏附于材料上。其中，0％和5％阿魏酸处理的材料表面的细胞呈跨越生长，并覆盖材料表面孔隙生长，细胞连接增多，细胞表面有微绒毛出现，说明细胞生长状态良好。而10％和15％阿魏酸处理组材料表面细胞数量较稀疏，生长的伪足不明显。　　 细胞活力检测结果显示:PHBV组和各对照组的吸光度值都随时间延长而逐渐升高(P＜0.05)。5％阿魏酸处理的材料的吸光度值高于其他各组(P＜0.05)，阴性对照组的吸光度值低于其他各组(P＜0.05)。　　 细胞周期法检测结果显示:PHBV组和各对比组的细胞增殖指数，即（S期+G2期）百分比均随时间延长而逐渐增高(p＜0.05)。5％阿魏酸处理的细胞增殖指数高于其他各组(p＜0.05)，PLA阴性对照组的细胞增殖指数低于其他各组(p＜0.05)。　　 实验结论：　　 骨髓间充质干细胞与阿魏酸处理的PHBV膜具有良好的生物相容性，体外培养环境下有利于细胞的生长、黏附和增殖。