尼古丁是烟草及其废弃物中的主要有害物,由于尼古丁易溶于水,如果不经过处理,会严重污染环境和威胁人体健康。目前为止,已知降解尼古丁的方法有物理法、化学法和生物法,其中微生物降解尼古丁具有效率高、成本低和环境友好性,与其他方法相比有更好的应用前景。AgrobacteriumtumefaciensS33是本实验室前期从烟草根系筛选出的菌株,能够高效降解尼古丁,前期研究显示,该菌株存在一条新的降解途径----噬尼古丁节杆菌降解尼古丁的“吡啶途径”和恶臭假单胞菌降解尼古丁的“吡咯途径”的杂合途径。本论文主要应用生物化学和分子生物学的方法对A.tumefaciens S33尼古丁降解机制进行研究。具体研究内容如下:为了对A.tumefaciens S33尼古丁降解生化途径深入分析,首先利用高通量Illumina测序技术对A.tumefaciens S33的基因组进行测定。根据测序初步分析结果对含有尼古丁降解基因的Scaffold 16中缺失区域的DNA序列进行了 PCR扩增和测序,获得完整的Scaffold 16序列,然后在Rast网站上对基因组进一步注释。基因注释结果显示,在Scaffold 16中存在多个移动元件蛋白、转录调控蛋白、接合转移蛋白等功能基因,推测Scaffold 16中一些基因包括尼古丁降解基因有可能是通过接合转移的方式进入到A.tumefaciens S33中。通过序列分析,发现参与菌株S33降解尼古丁的一些基因与其他菌株的相同功能基因具有较高的相似性,且形成一个基因簇。进一步利用RT-PCR对与菌株S33尼古丁降解相关的基因在尼古丁培养基和葡萄糖铵盐培养基中转录水平进行了分析,然后通过转录组测序对RT-PCR的结果进行了验证,发现相关基因经尼古丁诱导后的转录水平提高,同时可以得出尼古丁能够诱导尼古丁降解相关基因的表达。本实验室前期已对S33尼古丁降解关键酶尼古丁脱氢酶(Ndh)进行了初步纯化,为了进一步确定Ndh的编码基因,首先对纯化获得的Ndh蛋白样品进行胰蛋白酶消化,然后用MALDI-TOF/MS进行分析。结果显示,该蛋白样品中含有三个蛋白,大小分别为80 Da(NdhA)、73 Da(Pno)和16 Da(NdhB)。经保守序列分析发现,它们分别含有钼喋呤辅因子(NdhA)、黄素(Pno)和2Fe-2S(NdhB),这与节杆菌中具有相似功能的Ndh和酮脱氢酶结构组成一致。其中ndhA和ndhB有4 bp的重叠,但pno距离ndhB较远并且片段大于已报道具有类似功能的节杆菌中Ndh和酮脱氢酶中相应的亚基。为了进一步确定Ndh的编码基因,对三个基因分别进行了敲除。实验结果发现敲除菌株均不能在尼古丁培养基中生长,但都能以6-羟基-3-琥珀酰吡啶(HSP)为唯一碳氮源生长,另外只有pno的敲除菌株不能以6-羟基尼古丁为唯一碳氮源。敲除菌株的回补菌株均能降解尼古丁。为了确定Pno的催化反应,用pno敲除菌株的休止细胞催化尼古丁,通过LC-MS对催化产物鉴定发现Pno能催化尼古丁生成6-羟基尼古丁、6-羟基-N-甲基麦喔斯明和6-羟基假氧基尼古丁,但没有检测到6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶和HSP。考虑到基因组上尼古丁降解基因簇上还有一个醛脱氢酶编码基因adh,我们推测尼古丁脱氢酶由NdhA和NdhB组成,这与节杆菌中的尼古丁脱氢酶不同,是一个新型的尼古丁脱氢酶,而Pno则可能催化氧化6-羟基假氧化尼古丁生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶。6-羟基尼古丁氧化酶(Hno)是菌株A.tumefaciens S33尼古丁降解途径中的第二个关键酶。首先对菌株A.tumefaciens S33中的Hno进行分离纯化,对其进行胰蛋白酶消化后用MALDI-TOF/MS进行分析,确定了该酶的编码基因,它位于ndhB和ndhA下游,但转录方向与ndhB和ndhA相反,大小为1,314 bp,其蛋白序列与节杆菌的Hno具有24.8%的一致性。将基因hno在E.coli BL21(DE3)中进行了表达,并纯化得到了带组氨酸标签的Hno。LC-MS鉴定Hno催化产物发现该酶能催化6-羟基尼古丁生成6-羟基-N-甲基麦喔斯明,6-羟基-N-甲基麦喔斯明自发水解生成6-羟基假氧基尼古丁。另外,从菌株S33粗提液中对6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶(Hsh)进行了分离纯化和性质研究。发现该酶是一个90 kDa同源二聚体黄素蛋白,能够催化6-羟基-3-琥珀酰吡啶(HSP)生成2,5-二羟基吡啶(2,5-DHP)和琥珀酸。通过对纯酶N末端测序结果与基因组比对确定了该蛋白的基因,发现其位于pno下游约0.9 kb处,编码产物由391个氨基酸组成,与具有吡咯途径的Pseuudomonas putidaS16中的HSP羟化酶(HspB)一致性为62%。由于2,5-DHP在农业和医药上有重要的应用潜力,我们利用重组的Hsh和一个NADH可再生体系建立了转化HSP生成2,5-DHP的酶法发应体系,摩尔转化率达到了 69.7%。综上结果,通过基因组测序、转录组测序和关键酶的纯化及其生化分析对菌株S33降解尼古丁的分子机制进行了研究,发现菌株S33中的Ndh和Hno与具有吡啶途径的节杆菌中相应的酶相似,催化降解途径中间关键步骤的Hsh与具有吡咯途径的恶臭假单胞菌的HspB相似,且催化相同的反应;基因组序列比对也揭示了菌株S33具有与恶臭假单胞菌降解尼古丁吡咯途径中2,5-DHP之后的几步关键酶相似的基因;转录组测序进一步证明了这些基因是菌株S33尼古丁降解直接相关。这些结果与本实验室前期降解产物的化学鉴定和粗酶液活力测定的结果一致,进一步从生化和分子水平证实和揭示了菌株S33存在新的“吡啶途径”和“吡咯途径”的杂合途径。本论文还存在一些不足之处,例如从6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶降解生成HSP的酶及编码基因需要进一步分析研究和实验验证;此外Ndh的体内生理电子受体还未找到。