【摘 要】
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犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)是犬传染性肝炎的病原体,可感染不同品种和性别的犬类,以幼犬多发,死亡率高达40%。根据我国规定,犬传染性肝炎为实验用犬必检项目,普通级实验犬必须接种疫苗,而
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犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)是犬传染性肝炎的病原体,可感染不同品种和性别的犬类,以幼犬多发,死亡率高达40%。根据我国规定,犬传染性肝炎为实验用犬必检项目,普通级实验犬必须接种疫苗,而无特定病原体级实验犬不能接种疫苗,其血清抗体必须为阴性。现有的血清抗体水平检测方法都无法通过单次试验同时检测多种病原的抗体水平。液态芯片技术可以对同一样本中的不同目的分子同时进行定性和定量分析。本研究旨在利用液相芯片检测技术,建立犬Ⅰ型腺病毒抗体液相芯片检测方法,并为下一步建立犬主要病毒抗体液相芯片检测系统奠定基础。 本研究通过基因合成手段获得犬Ⅰ型腺病毒六邻体蛋白(Hexon)基因,并成功扩增出大小为2718bp的基因片段。将此基因片段克隆至杆状病毒供体质粒pFastBac Dual上,获得重组供体质粒Hexon-pFastBacDual;再将Hexon-pFastBacDual转化DH10Bac感受态细胞,经过两次抗性和蓝白斑筛选后,获得重组杆状病毒质粒Hexon-Bacmid。应用ExPASy服务器的在线分析工具分析六邻体蛋白的基本性质;利用生物学信息分析软件DNAStar分析六邻体蛋白的二级结构。结合六邻体蛋白的理化性质及其二级结构,综合运用DNAStar、在线分析工具Bepipred和ABCpred预测六邻体蛋白B细胞抗原表位。择优选取上述预测的B细胞抗原表位进行人工多肽合成。将合成抗原表位与荧光微球E5偶联,作为捕获微球,用于检测犬Ⅰ型腺病毒阳性血清和阴性血清。并对液相芯片捕获微球E5的用量、E5与血清的孵育时间、微球-血清与PE标记羊抗犬抗体的孵育时间、PE标记羊抗犬抗体的稀释倍数进行了优化。 本研究成功构建出携带犬Ⅰ型腺病毒六邻体蛋白基因的重组供体质粒及重组穿梭质粒,通过预测得到6段可能性较大的B细胞潜在抗原表位,建立了犬Ⅰ型腺病毒抗体液相芯片检测方法,为下一步建立犬主要病毒抗体液相芯片检测系统奠定基础。
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