第一部分 大鼠胚胎神经干细胞的培养、分化的观察 神经干细胞(Neural stem cell,NSC)是指中枢神经系统中具有自我更新能力并且能够分化产生成熟脑细胞(包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的多潜能细胞。已经证实,神经干细胞存在于胚胎或成年动物的中枢神经系统广泛区域,来自胚胎与成年动物的神经干细胞在本质属性上基本相同,而胚胎来源的神经干细胞培养扩增比较方便。本研究采用孕14天的大鼠的胎脑脑室下区、海马等结构来分离培养神经干细胞。一、材料与方法、动物:sprague一Dawley孕鼠3只(E一4)。2、主要试剂:0*25%的胰蛋白酶、B27添加剂、DMENfF12无血清培养液,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF);抗神经上皮干细胞蛋白抗体(Anti一estin IgG);抗胶质原纤维酸性蛋白抗体(A刀ti一GFAPIgG)、抗神经元特异性烯醇化酶抗体(A刀ti一SE IgG);免疫组化试剂。3、神经干细胞的原代培养及传代培养:自E14d SD大鼠取胚胎,无菌条件下取出脑室下区、海马等结构,0.25%胰酶与0.02%EDTA(l:l)消化成单细胞后,无血清悬浮培养神经干细胞,培养基为:DMEM/F12(l:l)、2%B27、EJ Zong/ml、bFGF 20ng/ml,37℃,5%Co:条件下悬浮培养。每2一3天换液,一周左右传代。4、神经干细胞的鉴定和分化:Nestin免疫细胞化学鉴定神经干细胞。取传代的神经干细胞以5 xl护/片的细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上,以含有10%胎牛血清的DME入盯F12培养液贴壁培养,分化培养5天后,作免疫细胞化学染色,神经元、胶质细胞分别用抗NSE抗体、抗GF妙抗体标记。二、结果1、原代培养的神经干细胞数目较少,培养第一天就可见大量细胞贴壁,少数细胞伸出突起,从培养的第4一5天开始,贴壁的细胞破裂、死亡,而未贴壁的细胞则悬浮于培养基中,细胞数目增多,形成小的神经球(Neurosphere),神经球逐渐增大。传代细胞呈球形悬浮于培养瓶中,细胞形态规则,未见明显突起生长,传代7天时神经球已生长成为数百个细胞的大克隆。经Nestin鉴定证实为神经干细胞。2、神经球直接做抗Nestin免疫细胞化学染色,所有细胞均为阳性。传代的神外科学浙江大学博士学位论文经干细胞分化培养5天后,分别作抗NSE、GFAP免疫细胞化学染色,结果显示部分细胞NSE阳性,GFAP阳性。在显微镜下可以看到神经干细胞少数分化为NSE阳性的神经元细胞,大多数分化为GFAP阳性的星形胶质细胞。三、结论 神经干细胞原代培养及传代培养的成功,为进一步实验,包括应用神经干细胞移植治疗神经外科疾病提供了坚实的基础。 在自然条件下神经干细胞的分化绝大多数向神经胶质细胞分化,向神经元分化的比例较少。第二部分神经干细胞移植治疗大鼠重度颅脑损伤的研究 重度颅脑损伤是神经外科危重急症,病死率高,幸存者也往往遗留后遗症。近年随着院前急救、显微神经外科、重症监护等技术进步,重度颅脑损伤的病死率有所下降。然而,重症颅脑损伤导致广泛而严重的神经细胞坏死、凋亡,脑的自身修复能力又极为有限,所以损伤导致的神经功能缺失难以恢复。目前的康复治疗对颅脑损伤后遗症的疗效很有限。神经干细胞具有自我更新能力和多分化潜能,一定条件下可以分化成神经系统的各种细胞,因此在修复受损神经组织方面有良好的应用前景。通过移植神经干细胞,修复损伤坏死的脑组织,是降低颅脑损伤致残率的有效途径。 本研究通过将胚胎神经干细胞移植到重度颅脑损伤大鼠的脑损伤部位,从行为学和形态学等方面探讨了神经干细胞移植治疗重症颅脑损伤的疗效,为神经干细胞将来在临床上的应用提供理论基础。一、材料和方法1、动物:Snrague一Dawley大鼠1 50只,雌雄各半,体重1 80一2209,年龄3个月左右。2、神经干细胞的标记:神经干细胞传代一天后,在培养基中加入BrdU,终浓度为30拌叭。24小时换液,神经干细胞即可用于移植。3、大鼠重度颅脑损伤模型的制作:采用改进的Feeney法自由落体损伤装置进行打击,将大鼠腹腔麻醉后置于立体定向仪上,509重砧码从25cm高处落下,撞击左顶部骨窗硬脑膜上,撞击面积IcmZ,撞击力为1250沙m,。4、移植神经干细胞:本步骤分为三个阶段:第一阶段首先将经过BrdU标记的神经干细胞离心收集,加入DMEM邝12培养基分别制成浓度为1 xl护/ml、1x 10v/ml、1 x 10s/ml的神经干细胞悬液待用。在颅脑损伤后第1天,将大鼠麻醉后打开原先骨窗,用微量进样器注射神经干细胞悬液。三组实验组大鼠分别移植不同浓度的神经干细胞悬液5川,对照组注射等量生理盐水,以确定最佳移植浓度。第二阶段分成三个时间点移植第一阶段所确定的最佳移植浓度的神经干细胞,时间点分别是损伤即时、损伤后一天、损伤后的第三天,以确定最佳的移植时间。第三个阶段根据前两个阶段所确定的最佳移植浓度和最佳移植时间,按三种途径(损伤部位、脑室内和静脉)移植神经干细胞,以确定最佳的移植途径。5、行为学判断:大鼠损伤后采用Bederson神经缺损体征评分法来检测神经功能恢复情况。6、免疫组化染色:术后第分别行HE染色、抗BrdU、15天处死所有的大鼠,切取脑组织制成石蜡切片,抗NSE免疫组化染色。