背景：肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞,具有正常干细胞相似的特性——自我更新的能力和多向分化的潜能,是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源。什么是肿瘤干细胞?目前认为肿瘤干细胞具有如下几个特点：(1)肿瘤组织中的极少量肿瘤细胞,具有强大的致瘤,转移和耐药能力。(2)无限的自我更新能力,肿瘤干细胞能够产生与上一代完全相同的子代细胞。(3)分化能力,肿瘤干细胞除了自我更新之外,还能够产生不同表型的肿瘤细胞,能够在体内形成新的肿瘤。(4)具有与非致瘤细胞(non tumorigenic cells)不同的表面标志。现今,人们已成功的从急性髓性白血病,多发性骨髓瘤,乳腺癌,脑肿瘤,非小细胞肺癌,黑色素瘤,前列腺癌和膀胱癌等多种类型的肿瘤患者组织中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。这证明在肿瘤细胞群体中确实存在一类极少数的能使群体扩增的肿瘤干细胞。肿瘤干细胞现已成为肿瘤研究的热点。目前,主要依据肿瘤细胞表面膜蛋白,粘附分子及受体的差异,通过一些假想的干细胞表面标记,如CD133、CD44等分离和鉴定肿瘤干细胞。但是由于大部分的肿瘤尚缺乏特异性的表面标记,因此肿瘤干细胞的分离纯化一直是长久以来亟待解决的难题之一。而侧群(Side Population, SP)细胞作为一种不通过寻找特异性的表面标记,利用荧光染料外排的特性来富集肿瘤干细胞,作为研究肿瘤干细胞的方法是一种理想的途径。SP细胞是指可将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外,在一步法骨髓造血干细胞分选时分离出的弱荧光信号细胞群。这群细胞在总量上只占整个骨髓细胞的0.05%,但却富含造血重建细胞,即造血干细胞。SP细胞现已经在多种正常组织被发现,如人和小鼠的骨髓、骨骼肌、神经系统等。此外,实体肿瘤标本以及肿瘤细胞系,如胃癌,前列腺癌,肺癌,胶质母细胞瘤等都可检测分离出SP细胞。但是在Wilms瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌细胞株HepG2和Huh6中却没发现SP。研究表明,SP细胞具有自我更新,多向分化潜能和修复组织的功能,肿瘤细胞株中的SP细胞还具有强大的致瘤能力和耐药能力,可能是肿瘤复发和耐药的根源。SP细胞高表达ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族成员ABCG2/Bcrpl(ATP-binding cassette superfamily G member 2/breast cancer resistance protein 1),并大多同时表达有相应干细胞的标记分子。ABCG2/BCRP1定位于细胞膜,具有“泵”的功能,因此SP细胞可将许多细胞毒化疗药物排出细胞外,从而使肿瘤对化疗药物产生耐药性。通过转基因技术增加ABCG-2/BCRP-1的表达可以使SP数量明显增加。接种免疫双缺陷品系的NOD/SCID鼠后显示,SP细胞具有极强的成瘤能力。目前来说,在缺乏显著的干细胞分子标记的情况下,SP细胞可作为研究肿瘤干细胞的一种重要途径。本课题利用实验室现有的FACS Aria的流式细胞仪,检测鼻咽癌细胞系5-8F中是否存在SP细胞亚群?如存在,SP与一些干细胞表面标记物之间的相互关系,并在体内外鉴定其生物学功能,分析其是否具有肿瘤干细胞的特性,并在临床标本中得到进一步验证。建立一个检测和分离鼻咽癌干细胞的方法和平台,为继续深入探讨鼻咽癌的病因、发生发展以及转移、复发、耐药等奠定基础。方法：一.鼻咽癌细胞系5-8F中SP细胞染色条件的优化荧光染料Hoechst33342孵育不同的时间和终浓度,利用流式细胞仪和倒置荧光显微镜共同分析,探讨获得SP细胞所需荧光染料Hoechst33342孵育的最佳时间和最合适的终浓度。研究细胞生长密度,孵育环境对SP细胞比例的影响。二.流式细胞仪检测SP细胞中ABCG2, CD133的表达,分析SP细胞与各表面标记物之间的相互关系荧光标记的抗体PE-ABCG2, CD133与荧光染料Hoechst33342共同染色,流式细胞仪分析几者之间的关系。三.细胞的分选和纯度鉴定利用流式细胞仪分选SP和MP细胞,倒置荧光显微镜和流式细胞仪对所分选的细胞进行纯度鉴定。四.Real-time PCR检测SP细胞中ABC转运蛋白家族,干性相关等基因的表达流式细胞仪分选出SP和MP细胞,抽提RNA,跑胶鉴定RNA的纯度和浓度,选取质量好的RNA, qRT-PCR检测相关基因的表达。五.SP细胞的生物学功能分析1.通过平板克隆形成试验,MTT检测生长曲线法比较SP和MP细胞体外的自我更新与自我增殖能力。同时,MTT检测比较SP和MP细胞耐药能力。2.分化潜能的测定：分选出SP和MP细胞体外培养段时间后,重新Hoechst33342荧光染料染色,流式细胞仪分析SP细胞亚群比例的变化。3. Boy den小室侵袭试验及Transwell体外迁移试验分析SP细胞亚群的侵袭和转移能力。4.流式细胞仪分析SP和MP细胞的细胞周期。5.裸鼠体内成瘤实验：不同数量的SP和MP细胞梯度2×105,1×105,1×104和5000个皮下种植裸鼠,4W后观察成瘤率。瘤组织HE染色,镜下观察结果。结果：一.鼻咽癌细胞系5-8F中SP细胞染色条件的优化1.荧光染料Hoechst33342孵育时间影响5-8F中SP细胞的检测Hoechst33342孵育时间为70min, SP细胞染色效果较佳。2.不同终浓度荧光染料Hoechst33342影响5-8F中SP细胞的检测Hoechst33342孵育的合适终浓度为3mg/L。3.不同细胞接种密度影响SP细胞的比例不同的细胞密度或者细胞融合度会影响SP细胞的比例。在一定的程度上,细胞的接种密度降低,其侧群细胞的比例也会相应的随之降低。相对于长满瓶底为100%的细胞,长满仅为70%的细胞,其SP细胞的比例降低,从2.3%降为0.8%。其都可以被Verapamil所抑制。4.不同孵育环境影响SP细胞的比例37℃恒温孵箱中较之恒温水浴箱中,SP细胞比例明显增高。可能孵箱中孵育导致SP染色不完全。二.流式细胞仪检测SP细胞中ABCG2, CD 133的表达,分析SP细胞与各表面标记物之间的相互关系SP细胞中高表达ABCG2蛋白,表达量占85.5%,而MP细胞表达仅为9.2%,即ABCG2蛋白富集表达与SP细胞中,SP表型与ABCG2的表达密切相关。而CD133蛋白,SP和MP细胞中的表达并没有显著性差异。SP细胞没有富集表达CD133。三.细胞的分选和纯度鉴定选择终浓度为3mg/L的荧光染料Hoechst33342孵育70min,圈出SP和MP细胞门,流式细胞仪分选出SP和MP细胞。1.倒置荧光显微镜镜下观察镜下观察MP细胞胞核被染色呈现较强蓝色荧光,SP细胞胞核蓝光较弱,应为拒染或淡染的细胞。(UV激发)2.重新上流式细胞仪检测,分析纯度达到98%以上。四.Real-time PCR检测SP细胞中ABC转运蛋白家族,干性相关等基因的表达干细胞相关基因OCT4 (t=-8.242, P=0.001), SOX2 (t=-3.560, P=0.024), BMI1 (t=-5.049, P=0.007), Klf4 (t=-5.479, P=0.005), C-Myc (t=-4.283,P=0.013)等在SP细胞中表达均高于MP细胞,差异具有统计学意义。ABC转运蛋白家族成员ABCG2 (t=-12.775, P=0.000), MDR1 (t=-6.366, P=0.003), ABCC2(t=-6.058, P=0.004) SP细胞亦高表达,但ABCA5 (t=-2.838, P=0.098)两者的表达没有统计学意义。膜表面标记物CD44, SP细胞较MP细胞高表达,具有统计学差异(t=-5.860, P=0.004),但两种细胞中CD133的表达没有统计学意义(t=-1.037,P=0.358)五.SP细胞的生物学功能分析流式细胞仪分选出SP和MP细胞,体外生物学实验检测其增殖、更新、迁移和分化潜能,体内裸鼠成瘤试验检测其致瘤能力。1.采用MTT法与平板克隆形成试验检测SP细胞的体外增殖情况,MTT法同时检测SP细胞耐药情况MTT生长曲线结果提示：与MP细胞相比,SP细胞的增殖能力明显增强,两者具有显著性差异(F=683.216,P=0.000)。平板克隆形成实验结果提示：SP细胞体外培养其克隆形成率(49.111±2.912)%明显多于MP细胞(23.111±2.009)%,两者具有显著性差异(t=12.729, P=0.000)。与MP细胞相比,SP细胞体外自我更新,增殖能力更强。MTT耐药曲线结果提示：SP细胞较MP细胞耐药性更强(F=362.120, P=0.000),差异具有统计学意义。SP细胞的IC50=0.104±0.011,MP细胞的IC50=0.051±0.006,两者差异具有统计学意义(t=10.078, P=0.000)。2.分化潜能实验流式细胞仪分选后的SP和MP细胞,10%PAA小牛血清完全培养基培养。倒置荧光显微镜下(UV激发)：98%以上的SP细胞胞胞核蓝光较弱,应为拒染或淡染的细胞,MP细胞胞核被染色呈现较强蓝色荧光。体外培养6天后,重新上流式细胞仪检测SP细胞的比例。SP细胞培养6天后,其侧群比例由98%降为1%,提示大部分的SP细胞在体外培养的环境下分化成为NSP细胞。MP细胞培养6天后,其侧群比例为0.1%,提示可能是上次分选时SP细胞的污染。3.体外侵袭和迁移能力Transwell迁移实验：细胞培养16小时后,SP细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数(94.000±9.615)明显多于MP细胞(19.200±5.263),两者具有显著性差异(t=15.826, P=0.000)。Boyden小室侵袭实验：细胞培养48小时后,SP细胞穿过基底膜的细胞数(302.200±15.271)明显多于MP细胞(187.400±6.914),两者差异具有显著性(t=15.313, P=0.000)。提示：SP细胞侵袭运动能力较MP细胞强,与肿瘤侵袭和转移可能相关。4.细胞周期流式细胞仪(BD Calibur)检测细胞周期结果显示,SP细胞Go/G1期细胞(62.900±2.800)%较MP细胞(54.600±2.551)%比例多,差异具有显著性(t=3.795,P=0.019)。S期细胞数目比例SP细胞为(29.933±0.702)%,MP细胞为(29.867±0.702)%,两者没有统计学差异(t=0.116,P=0.913),G2/M期细胞MP细胞(15.500±3.305)%较SP细胞比例(7.167±2.101)%多,差异有显著性(t=-3.686,P=0.021)。SP细胞增殖指数PI=39.9%,MP细胞增殖指数PI=47.9%,差异具有统计学意义(t=-3.795,P=0.019)。提示：SP细胞是一类多处于G0/G1期的细胞,推测其可能是一种处于相对静息期状态的细胞。5.裸鼠体内成瘤实验注射细胞总数分别为2×105,1×105,1×104和5000个SP细胞观察4W,均可见瘤体形成,成瘤所需要的最低细胞数仅为5000个。而MP细胞注射细胞数目1×104和5000个,观察4W均未见瘤体形成,注射2×105细胞才可见肿瘤形成。提示SP细胞较MP细胞有更强大的致瘤能力。结论：一.鼻咽癌细胞系5-8F中SP细胞所需荧光染料Hoechst33342最佳的9孵育时间为70 min,最合适的孵育浓度为3mg/L。SP亚群比例为2.3%。不同的孵育环境影响SP的检测。一定程度上,SP细胞的比例呈密度依赖。二.流式细胞仪和倒置荧光显微镜鉴定,分选SP和MP细胞的纯度达到98%以上,为进一步研究SP细胞提供生物学功能奠定了基础。三.SP和MP细胞体内外功能试验具有明显的差异。SP细胞是一类处于相对静息期的细胞,体外培养具有自我更新,自我增殖和多向分化潜能,以及强大的致瘤和侵袭,转移能力。具有肿瘤干细胞样特性。四.SP细胞富集表达干细胞相关基因。高表达ABC转运蛋白家族成员ABCG2等,与肿瘤耐药性密切相关。五.已证实的其他肿瘤的表面标记物却并未富集在SP细胞中,推测膜表面蛋白CD133可能并不是鼻咽癌的干细胞标记物。其机理有待进一步探讨。