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群感效应(QS)是一种常见且重要的细菌交流机制，当菌体密度到达临界值，产生和释放(分泌)的信号分子在胞外积累到阈值浓度使特定受体识别时，调控胞内特定结构基因的表达，从而产生的群体效应。N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)作为革兰氏阴性菌重要的群感效应信号分子参与调控多种致病菌基因的表达，主要表现为运动性变化，毒力因子产生和生物膜形成等。群感淬灭(QQ)即通过干扰或中断群感效应中的信号传递来淬灭群感效应。群感淬灭实现的主要方式可通过对信号分子的酶学降解或修饰以达到干扰或抑制群感效应，其中N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类通过降解AHLs的群感淬灭酶。与杀菌抑菌策略相比，群感淬灭并不对细菌的生存产生选择压力，也不直接作用于细菌的生长，故不会对细菌产生抗性。因此，通过N-酰基高丝氨酸内酯酶实现的群感淬灭代表了一种有前景的抗致病策略，可用于防控致病菌。
本研究从KurthiahuakuiiLAM0618T中克隆了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiK，经EscherichiacoliBL21(DE3)表达，Ni-NTA纯化后获得AiiK蛋白，用于分析酶学特性和淬灭铜绿假单胞菌群感效应。考虑到AiiK的纯化过程相对繁琐且纯化后的AiiK实际使用成本高，抗逆性差等因素。本研究基于干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiMCJΔ1)表达系统，构建了三种重组表达菌株pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1，pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1和pELCW-aiiK/L.caseiMCJΔ1(LCAiiK)，并将重组菌株LCAiiK用于淬灭嗜水气单胞菌群感效应。具体研究结果如下：
1.AiiK与已知的N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA和AiiB具有较低的相似性，分别为26%和42%，且多序列比对结果和酸化实验结果表明AiiK是一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，故AiiK是一种新的N-酰基高丝氨酸内酯酶。AiiK可降解底物C6-HSL、3-Oxo-C6-HSL、C10-HSL和C14-HSL。在以C10-HSL为底物的条件下，AiiK的kcat/Km值为3.9s–1?mM–1，且4μg/mL的AiiK在25℃下反应30min可降解97%(即48.5μM)的C10-HSL。AiiK的最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.5，1mM的Co2+，Mn2+，Mg2+和Ni2+可以提高AiiK的活性，AiiiK经蛋白酶处理60min后活性仍能保持在100%以上。
2.当纯化后的AiiK使用量达到10μg/mL时，其对铜绿假单胞菌POA1生物膜形成、胞外蛋白酶水解活性和绿脓菌素产生的抑制率分别为40.78%、47.30%和71.30%，同时AiiK并不抑制其菌体生长。因此，AiiK对铜绿假单胞菌POA1具有良好的群感淬灭作用且不产生抗性，达到了预期的生物防控效果。
3.重组菌株pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1(胞内表达)，pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1(分泌表达)和LCAiiK(细胞壁外的表面层表达)的粗酶提取液都展现了AiiK活性，其中LCAiiK的AiiK活性与pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1的AiiK活性相近，都明显高于pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1的AiiK活性，而LCAiiK的粗酶提取液制备最为简单。同时重组菌株LCAiiK中的质粒pELCW-aiiK在无红霉素存在的条件下连续传代15代后依然能保持50%以上的质粒稳定性。
4.重组菌株LCAiiK可以显著地抑制嗜水气单胞菌AH-1和AH-4的泳动能力、溶血活性、胞外蛋白酶活性和生物膜的形成。因此，LCAiiK对嗜水气单胞菌具有良好的群感淬灭作用，达到了预期的生物防控效果。
本研究聚焦于N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiK，首次在Kurthia属中发现了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiK，鉴定了AiiK是新的N-酰基高丝氨酸内酯酶，并首次用乳酸菌L.caseiMCJΔ1表达了N-酰基高丝氨酸内酯酶。纯化后的AiiK和重组菌株LCAiiK分别对致病菌铜绿假单胞菌POA1和嗜水气单胞菌展现了良好的群感淬灭作用，达到了预期的生物防控效果。
本研究从KurthiahuakuiiLAM0618T中克隆了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiK，经EscherichiacoliBL21(DE3)表达，Ni-NTA纯化后获得AiiK蛋白，用于分析酶学特性和淬灭铜绿假单胞菌群感效应。考虑到AiiK的纯化过程相对繁琐且纯化后的AiiK实际使用成本高，抗逆性差等因素。本研究基于干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiMCJΔ1)表达系统，构建了三种重组表达菌株pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1，pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1和pELCW-aiiK/L.caseiMCJΔ1(LCAiiK)，并将重组菌株LCAiiK用于淬灭嗜水气单胞菌群感效应。具体研究结果如下：
1.AiiK与已知的N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA和AiiB具有较低的相似性，分别为26%和42%，且多序列比对结果和酸化实验结果表明AiiK是一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，故AiiK是一种新的N-酰基高丝氨酸内酯酶。AiiK可降解底物C6-HSL、3-Oxo-C6-HSL、C10-HSL和C14-HSL。在以C10-HSL为底物的条件下，AiiK的kcat/Km值为3.9s–1?mM–1，且4μg/mL的AiiK在25℃下反应30min可降解97%(即48.5μM)的C10-HSL。AiiK的最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.5，1mM的Co2+，Mn2+，Mg2+和Ni2+可以提高AiiK的活性，AiiiK经蛋白酶处理60min后活性仍能保持在100%以上。
2.当纯化后的AiiK使用量达到10μg/mL时，其对铜绿假单胞菌POA1生物膜形成、胞外蛋白酶水解活性和绿脓菌素产生的抑制率分别为40.78%、47.30%和71.30%，同时AiiK并不抑制其菌体生长。因此，AiiK对铜绿假单胞菌POA1具有良好的群感淬灭作用且不产生抗性，达到了预期的生物防控效果。
3.重组菌株pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1(胞内表达)，pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1(分泌表达)和LCAiiK(细胞壁外的表面层表达)的粗酶提取液都展现了AiiK活性，其中LCAiiK的AiiK活性与pELX1-aiiK/L.caseiMCJΔ1的AiiK活性相近，都明显高于pELSH-aiiK/L.caseiMCJΔ1的AiiK活性，而LCAiiK的粗酶提取液制备最为简单。同时重组菌株LCAiiK中的质粒pELCW-aiiK在无红霉素存在的条件下连续传代15代后依然能保持50%以上的质粒稳定性。
4.重组菌株LCAiiK可以显著地抑制嗜水气单胞菌AH-1和AH-4的泳动能力、溶血活性、胞外蛋白酶活性和生物膜的形成。因此，LCAiiK对嗜水气单胞菌具有良好的群感淬灭作用，达到了预期的生物防控效果。
本研究聚焦于N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiK，首次在Kurthia属中发现了N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiK，鉴定了AiiK是新的N-酰基高丝氨酸内酯酶，并首次用乳酸菌L.caseiMCJΔ1表达了N-酰基高丝氨酸内酯酶。纯化后的AiiK和重组菌株LCAiiK分别对致病菌铜绿假单胞菌POA1和嗜水气单胞菌展现了良好的群感淬灭作用，达到了预期的生物防控效果。