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背景与目的:牙周炎是以牙齿周围支持组织破坏为主要特征的口腔感染性疾病,其造成的附着丧失及牙周骨组织的破坏是导致牙齿松动、脱落的首要原因。现有的临床治疗策略可以很好的控制牙周炎症的进展,但已破坏的牙周组织,特别是牙周骨组织如何实现再生仍然是临床工作面临的难题。原位牙周组织工程是通过各种途径诱导组织局部和外周血液循环中的相关功能细胞迁移、归巢到牙周缺损区域,并在缺损区进行增殖、分化促进组织再生,进而修复缺损,为牙周组织再生提供了新的策略。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)作为成体间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成员之一,具备自我更新和多向分化的潜能,是众多牙源性干细胞中诱导牙周组织再生最有利的细胞来源。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)可以通过激活G-蛋白偶联的特异性受体4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)进而促进多种干细胞迁移、归巢至创区,为组织再生提供干细胞来源。然而SDF-1自身诱导干细胞分化的能力有限,仅通过单独应用SDF-1并不能让牙周骨组织再生取得令人满意的效果。二甲双胍(metformin,MF)作为一种成熟的降糖药物已在临床应用多年,近年来的研究发现MF在降糖作用外还具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老及促进干细胞成骨分化等作用。艾塞那肽(Exendin-4,EX-4)是胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物,也是临床目前较为常用的降糖药物,除具有保护神经、心脏,抗炎及抗氧化等多种作用外,还能正向调节骨代谢。此外,EX-4是SDF-1/CXCR4信号轴的重要调控因子,可以通过上调干细胞表面受体CXCR4的表达,进而增强SDF-1对相关功能细胞的募集能力。基于以上理论基础,为了寻求更好的促进骨再生的药物,本课题首先探究了MF、EX-4在体外对人PDLSCs的增殖、迁移以及成骨分化能力的影响;其次,我们通过检测SDF-1分别与MF、EX-4联合应用对PDLSCs表面CXCR4受体表达水平的促进作用,筛选出效果更强的药物;再次,我们利用体外及体内实验对SDF-1与EX-4联合应用促进PDLSCs增殖、迁移以及成骨分化的协同效应和对Wistar大鼠下颌牙周骨缺损组织再生的协同效应进行了深入探讨,以期为牙周原位骨组织再生提供新的策略。材料与方法:1 MF、EX-4对PDLSCs增殖、迁移及成骨分化的影响1.1 PDLSCs的分离、培养及鉴定选取因正畸治疗需要拔除的健康前磨牙,获得根中1/3的牙周膜组织,采取有限稀释法分离、培养获得人PDLSCs,并利用克隆形成实验及流式分析方法对其干性及来源进行鉴定。1.2 MF、EX-4对PDLSCs增殖及迁移能力的影响通过细胞活性检测试剂盒(cell-counting kit 8,CCK-8)及Transwell实验检测MF、EX-4分别对PDLSCs增殖、迁移能力的影响。1.3 MF、EX-4对PDLSCs成骨分化能力的影响通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、茜素红染色、氯代十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)比色法及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)来评估 MF、EX-4 分别对PDLSCs成骨分化能力的影响。2 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs增殖、迁移及成骨分化的影响2.1人PDLSCs表面CXCR4受体表达检测免疫荧光染色法检测PDLSCs表面CXCR4受体的表达。2.2 SDF-1 浓度筛选通过CCK-8及Transwell实验检测SDF-1对PDLSCs增殖及迁移能力的影响,筛选出SDF-1最佳的作用浓度。2.3 SDF-1联用药物筛选通过qRT-PCR检测SDF-1分别与MF、EX-4联用对PDLSCs表面CXCR4受体表达水平的作用,筛选出协同效应更强的药物应用于后续实验。2.4 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs增殖及迁移能力的影响通过CCK-8和Transwell实验检测SDF-1与EX-4联用对PDLSCs增殖、迁移能力的协同效应。2.5 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs成骨分化能力的影响通过ALP活性、茜素红染色、CPC 比色法及qRT-PCR来评估SDF-1与EX-4联用对PDLSCs成骨分化能力的协同效应。3 SDF-1与EX-4联合应用对Wistar大鼠牙周骨组织再生的影响3.1建立Wistar大鼠下颌牙周骨缺损实验模型将220-250 g(8周龄)的健康雄性Wistar大鼠编号,随机分成两大组:①组每日腹腔注射EX-4;②组每日注射等量生理盐水。在大鼠两侧下颌骨分别制备5 mm×4mm×1 mm大小的牙周骨缺损,右侧缺损内置入负载SDF-1的生物膜,左侧缺损内置入负载PBS的生物膜。分别于术后3d、1、2、4 w获取下颌骨标本,进行以下实验。3.2 SDF-1与EX-4联合应用对缺损区域MSCs和CXCR4+细胞募集的影响制作石蜡切片,通过免疫荧光双染(CD90+/CD34-)和CXCR4免疫荧光染色检测SDF-1与EX-4联用对大鼠下颌牙周骨缺损区域的干细胞募集作用。3.3 SDF-1与EX-4联合应用对缺损区域牙周骨组织再生的影响通过微型计算机断层扫描(micro-computed tomography,Micro-CT)分析比较各组缺损区域新骨形成的骨体积分数(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨表面积组织体积比(bone surface area/tissue volume,BS/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)和骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp);制作石蜡切片,通过苏木素&伊红(Hematoxylin&eosin,H&E)染色检测各组新骨形成;通过TRAP染色检测各组缺损区域破骨细胞数量;通过免疫组织化学染色检测成骨相关蛋白ALP、Ⅰ型胶原蛋白(collagentypel,ColI)的表达。结果:1 MF、EX-4对PDLSCs增殖、迁移及成骨分化的影响1.1 PDLSCs的分离、培养及鉴定通过有限稀释法获得人PDLSCs,原代细胞呈现出典型的长梭形形态。人PDLSCs具备克隆形成能力,其MSCs源性表面标志物CD29、CD44、CD73表达呈阳性,造血干细胞(hemopoietic stem cells,HSCs)源性表面标志物CD45表达呈阴性。1.2 MF、EX-4对PDLSCs增殖和迁移能力的影响CCK-8结果显示,与对照组相比,10 μM MF对PDLSCs的增殖能力无显著影响(P>0.05),50 μM和100 μM MF能够明显促进PDLSCs的增殖(P<0.01)。5、10、20及50 nM EX-4对PDLSCs增殖无显著影响(P>0.05)。Transwell结果显示,与阴性对照组(negative control,NC)相比,各浓度MF和EX-4均能显著促进PDLSCs的迁移(P<0.01),其中,50 μMMF和10 nM EX-4对PDLSCs迁移能力的促进效果最为显著(P<0.01)。1.3 MF、EX-4对PDLSCs成骨分化能力的影响ALP活性检测结果显示,与对照组相比,各浓度MF和EX-4均可明显增强PDLSCs的ALP活性(P<0.05),其中50μM MF和10 nMEX-4的促进效应最为显著(P<0.05)。茜素红染色及CPC比色法结果显示,与对照组相比,50 μMMF和10 nM EX-4可显著增强PDLSCs细胞外矿化结节形成能力及钙盐沉积(P<0.001)。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,50 μM MF和10 nM EX-4可以显著上调PDLSCs成骨相关标志物ALP、runt相关转录因子2(runtrelatedtranscription factor2,Runx2)及骨钙素(osteocarlcin,OCN)的表达水平(P<0.05)。2 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs增殖、迁移及成骨分化的影响2.1人PDLSCs表面CXCR4受体表达免疫荧光染色结果显示人PDLSCs表面CXCR4表达呈阳性。2.2 SDF-1浓度筛选CCK-8和Transwell结果显示,与其他浓度相比,50 ng/mL SDF-1促进PDLSCs增殖和迁移效应最为显著(P<0.05)。2.3 SDF-1联用药物筛选qRT-PCR结果显示,与对照组相比,SDF-1组和SDF-1+MF联用组CXCR4表达水平均显著升高(P<0.001),但SDF-1组和SDF-1+MF联用组间CXCR4受体表达水平无明显差异(P>0.05);SDF-1+EX-4联用组PDLSCs表面CXCR4受体表达水平明显高于对照组、SDF-1组及EX-4组(P<0.01),故后续实验中选取SDF-1与EX-4进行联合应用。2.4 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs增殖和迁移能力的影响CCK-8结果显示,与对照组相比,SDF-1对PDLSCs增殖能力表现出明显的促进作用(P<0.001),且SDF-1和EX-4联用对PDLSCs的增殖能力表现出更为显著的协同促进效应(P<0.001),其协同促进效应明显优于两种药物各自单独作用(P<0.001)。Transwell结果显示,与NC组相比,SDF-1、EX-4均可以明显促进PDLSCs的迁移能力(P<0.001),且SDF-1和EX-4联用对PDLSCs的迁移能力表现出显著的协同促进效应(P<0.001),显著优于两种药物各自单独作用(P<0.001)。2.5 SDF-1与EX-4联合应用对PDLSCs成骨分化能力的影响ALP活性检测、茜素红染色、CPC 比色法及qRT-PCR结果均表明SDF-1、EX-4均可以显著促进PDLSCs的ALP活性(P<0.001)、细胞外矿化结节形成能力(P<0.001)和成骨相关标志物ALP、OCN、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的表达水平(P<0.05),且SDF-1与EX-4联用产生的协同效应均显著优于两种药物各自单独作用。3 SDF-1与EX-4联合应用对Wistar大鼠牙周骨组织再生的影响3.1大鼠牙周骨缺损模型的建立实验动物在术后全部存活,麻醉苏醒后生命体征良好,未见明显炎症反应及排斥反应。3.2 SDF-1与EX-4联合应用对缺损区域干细胞募集的作用CD90+/CD34-免疫荧光双染结果显示,与对照组相比,在愈合早期(3d、1、2 w)SDF-1与EX-4联合应用所募集的MSCs数量明显增多,且明显高于药物单独应用组(P<0.05)。CXCR4免疫荧光染色结果显示,在愈合早期(3d、1、2 w),SDF-1与EX-4联用组缺损区域的CXCR4+细胞数量明显升高,且明显高于对照组及药物单独应用组(P<0.05)。3.3 SDF-1与EX-4联合应用对缺损区域牙周骨组织再生的影响Micro-CT结果显示,与对照组和药物单独应用组相比,在术后1、2、4、8 w,SDF-1与EX-4联用组的再生骨量明显增多,BV/TV、BS/TV、Tb.Th明显升高,Tb.Sp 明显下降(P<0.05);H&E染色结果显示,与对照组和药物单独应用组相比,SDF-1与EX-4联用组对缺损区域的成骨能力具有促进作用,新生骨的面积更大、骨小梁密度更为致密(P<0.05)。TRAP染色结果表明SDF-1与EX-4联用组可以显著增加术后3 d和1 w缺损区域内破骨细胞的数量,术后TRAP+细胞数量明显高于SDF-1组、EX-4组及对照组(P<0.05)。免疫组化染色显示,SDF-1与EX-4联用组的ALP(1、2 w)和Col I(2、4、8w)表达量明显高于对照组和药物单独应用组(P<0.05)。结论:1人PDLSCs可通过有限稀释法分离培养获得。2MF可以显著地促进PDLSCs的增殖、迁移以及成骨分化能力,最佳浓度为50 μM。3 EX-4可以显著地促进PDLSCs的迁移和成骨分化能力,其中最佳浓度为10 nM。4 人PDLSCs表面CXCR4受体表达呈阳性。SDF-1与EX-4联合应用可以显著上调PDLSCs表面CXCR4受体的表达水平,同时对PDLSCs的增殖、迁移以及成骨分化能力表现出显著的协同促进效应。5 SDF-1与EX-4联合应用能够增强SDF-1对干细胞的募集效应,二者联合应用可以募集更多的MSCs迁移归巢至牙周骨缺损区域,为牙周骨组织再生提供干细胞来源。6 SDF-1与EX-4联合应用能够促进新骨形成,显著促进牙周骨缺损的修复和再生,二者联用产生的协同促进效应显著优于各自单独应用。