禽呼肠孤病毒和传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测方法的研究

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环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新型的核酸扩增方法,仅需一个简单的恒温反应器就能够在等温条件下高效、快速对DNA进行扩增的分子生物学技术。本研究建立了禽呼肠病毒(Avian reovirus, ARV)的LAMP检测方法。基于禽呼肠病毒的p10基因8个区域的6条LAMP引物,能够在等温(63℃)条件下1h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低能够检出102个拷贝的病毒,敏感性比普通PCR高100倍,而对其他病毒检测结果为阴性。在荧光显色中分别应用SYBR Green I和钙黄绿素作为显色剂,其结果与琼脂糖凝胶电泳一致。在对80份临床阳性样本的检测中,使用LAMP和PCR检测出阳性样本的数量分别为68份和55份。同时,本研究还建立了传染性支气管炎病毒(IBV)的5a+5b基因序列8个区域的6条LAMP引物设计一套LAMP引物,建立了一种基于荧光显色的IBV逆转录环等温扩增检测方法。该方法能够在等温(63℃)条件下1h完成反应。该方法具有良好的敏感性和特异性,能够检出1个拷贝的阳性重组质粒,比普通PCR高100倍,而不能检出其他病毒。用HNB进行反应显色,其结果与琼脂糖凝胶电泳一致。在对60份临床阳性样本检测中,使用LAMP和PCR检测的检出率分别为49份和42份。与PCR相比,LAMP快速,操作简便、成本低廉,只需要一个小时就能完成检测。另外,通过添加显色剂,在反应结束后即可直接观测判定结果。鉴于LAMP的诸多优点,本文建立的ARV-LAMP和IBV-LAMP方法适合在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。
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