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研究奶牛乳腺发育,提高奶牛的产奶量及乳品质是奶牛遗传育种工作的重中之重。本实验室前期的研究表明MEN1/menin的表达水平对于奶牛乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白的合成具有重要的调控功能,但调节MEN1/menin表达的上游调节因素目前尚未知。软件预测bta-miR-24-3p可以与MEN1的3’UTR互作进而调节其表达水平。本研究旨在研究bta-miR-24-3p是否对于MEN1的表达存在调节作用,并解析其在乳腺上皮细胞中的功能。本研究利用脂质体转染技术在细胞水平检测miRNA表达变化对奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成的影响;调控乳蛋白合成的两条重要信号途径是PI3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路,研究miRNA对两条信号通路的调控对研究奶牛乳腺内乳蛋白的合成有重要意义。主要研究结果如下:(1)Target Scan 6.2和RNAhybrid 2.2两种软件筛选出调控MEN1基因表达的bta-miR-24-3p,MAC-T中重组质粒pMIR-REPORT-bMEN1-3’UTR与bta-miR-24-3p mimics/inhibitor进行共转染,发现bta-miR-24-3p能够特异靶向MEN1基因mRNA的3’UTR。(2)瞬时转染bta-miR-24-3p mimics/inhibitor发现二者均在转染后24h表达效果最好,并且能够负向调控MEN1基因的表达;瞬时转染重组质粒pEGFP-C2-bMEN1及siRNA发现MEN1基因能够正向调控bta-miR-24-3p的表达。(3)细胞计数及CCK-8检测细胞增殖,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞增殖,但bta-miR-24-3p inhibitor无显著影响;流式细胞术检测细胞周期,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞周期由C0/G1期向S期进行,qRT-PCR检测细胞周期因子发现CyclinD1、CDK6显著升高(P<0.01),CDK4(P<0.01)、p27(P<0.05)显著降低,而p18无明显变化。bta-mi R-24-3p inhibitor对细胞周期无显著影响,qRT-PCR检测细胞周期因子发现CyclinD1(P<0.05)、CDK6(P<0.01)显著降低,CDK4、p18、p27无明显变化(P>0.05)。(4)qRT-PCR检测发现,bta-miR-24-3p mimics可在mRNA水平显著降低包括AKT(P<0.01)、mTOR(P<0.01)、4E-BP1(P<0.05)、STAT5(P<0.01)在内的与乳蛋白合成相关基因的表达,并能降低CSNK(P<0.05)的表达。bta-mi R-24-3p inhibitor则表现出相反的调节作用。综上所述,奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中bta-miR-24-3p能够靶向MEN1基因;bta-miR-24-3p能够负向调控MEN1基因的表达,而MEN1基因对bta-miR-24-3p进行正向调控;bta-miR-24-3p能够促进MAC-T细胞增殖,并能促进细胞周期由G0/G1期向S期进行;此外bta-miR-24-3p可负向调控包括PI3K/AKT/mTOR信号通路及JAK2/STAT5信号通路在内的与乳蛋白合成相关因子的表达,进而负向调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成。