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壳聚糖为目前发现的唯一一种天然阳离子多糖,它在自然界中分布广泛,储量丰富。壳寡糖为壳聚糖的水解产物,具有壳聚糖抗菌、抗肿瘤和抗氧化等独特生理活性;同时,又因为壳寡糖低分子量、高水溶性和易被生物体吸收等特点,更利于工业生产和利用。红树林生态系统结构复杂,其中蕴含着丰富的微生物资源,存在数量繁多的甲壳类生物,是天然壳聚糖的重要产地。 本研究通过纯培养技术,从广西亚热带海洋土壤沉积物样品中分离筛选得到四株能够在壳聚糖筛选平板上产生水解圈的菌株,经过复筛后选择其中壳聚糖酶活力最高的菌株GZ1进行菌种鉴定。鉴定结果表明,菌株在显微镜下观察为杆状,革兰氏染色呈阳性,有芽孢和荚膜,在培养基上菌落生长较大,颜色呈黄色,表面粗糙不透明,边缘呈不规则波浪状。同时,经过16S rDNA测序后发现GZ1与Bacillussubtilis strain CS10有99%一致性,进化树构建结果显示亲缘性最近菌株为Bacillus subtilis strain CS10,结合菌株GZ1的常规生理生化性质鉴定,菌株GZ1可鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis GZ1。 采用DNS法测定发酵液的壳聚糖酶活力,同时对粗酶液的最适反应温度与pH进行了测定,测定结果显示粗酶液的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.5。 进行氮源、碳源、pH值、装液量、转速、温度和壳聚糖量的单因素实验,并根据单因素实验结果进行了氮源浓度、pH值、装液量和温度的四因素三水平正交实验,最终所得到的最适氮源为1%蛋白胨、最适碳源为1%可溶性淀粉、最适发酵温度为20℃、最适发酵pH为7.5、最适装液量为80mL/250mL、最适培养转速为180rpm、最适壳聚糖量为0.75%、培养时间为2d。在最优发酵条件下进行发酵产酶,测定所得发酵液最高酶活力为1.886U/mL,为优化前的2.6倍。在本研究中,经过正交实验优化后,除了温度没有改变外,其他几个因素相对于单因素实验都有一定的变化,因此,在Bacillus subtilisGZ1的发酵条件优化中,各因素间的相互作用可能影响较大,以响应面法来进行条件优化应该能取得更好的效果。 当前报道的重组表达壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌发酵产酶能力大都较高,与之相比,Bacillus subtilis GZ1为野生型菌株,未经过改造,发酵产酶能力较低。因此,通过对Bacillus subtilis GZ1壳聚糖酶基因的启动子与拷贝数进行改造的方式,应能使Bacillus subtilis GZ1的发酵产壳聚糖酶能力有一个较大的提升。此外,枯草芽孢杆菌为动物饲料的常用添加剂,而Bacillus subtilis GZ1所产壳聚糖酶最适反应温度较高,达到55℃,较高的酶反应温度使其在饲料工业的生产中有一定的应用价值和参考价值。