一、研究背景:临床上许多进展期肾癌患者已经失去手术机会,接受手术的患者将近有三分之一会发生复发和转移。抗血管治疗药物是针对血管内皮生长因子(VEGFR)受体的较为有效的治疗方法,抗血管药物同时阻滞络氨酸激酶受体(RTK),目前肾癌治疗一线靶向药物中舒尼替尼最为常用。令人惋惜的是有将近五分之一的肾癌患者对抗血管治疗不敏感,剩下的患者最终再接受一到多个疗程之后也会发展为耐药。许多患者因为中断了舒尼替尼的治疗最终导致快速的复发和转移,所以开发新型的抗肿瘤药物迫在眉睫。随着纳米科技的快速发展,各种纳米药物的药效学得到深入研究,其中一些甚至进入临床试验和临床治疗。在这些纳米药物中,无机纳米药物得到广泛研究,其中一些也在临床试验中得到理想效果。四氧化三铁纳米粒已经被美国FDA食品与药品监督局批准并认可应用于贫血的治疗。最近,四氧化三铁纳米粒显示出抗巨噬细胞的效应,这样就有潜能应用于肿瘤的生物免疫治疗。而且,银纳米粒已经在妇产科感染性疾病的治疗中取得一定疗效。其它无机纳米药物,例如:纳米氧化锌和纳米金,仍然有成为抗肿瘤药物的很大潜藏价值。在我们的前期研究中,氧化亚铜纳米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles,CONPs)展示出理想的抗肿瘤效果和很低的生物毒性。铜伴侣蛋白调节细胞内铜离子转运和剂量,在肿瘤的进展中也扮演了重要角色。纳米药物和铜伴侣蛋白相互作用的机制尚未得到深入研究。二、目的:明确CONPs如何左右肾癌细胞的生物学行为,并在肾癌在体动物模型的实验中进行验证。在药效学实验阳性的基础上,进一步探讨CONPs对抗肾癌进展的分子学机制,并寻找该药物抑制肾癌生长并诱导其凋亡的靶点。三、方法:1、通过CCK8法评估CONPs作用于肾癌细胞后,其细胞活力和增殖效应的变化,并通过TRANSWELL实验检测CONPs对肾癌细胞迁移和侵袭的影响,采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒在流式仪上对CONPs是否诱导肾癌细胞凋亡进行验证。通过流式仪并利用Cell cycle staining Kit检测CONPs对肾癌细胞周期的效应。2、RNA提取和qRT-PCR检测CONPs作用后肾癌细胞转录水平RNA变化情况,WB实验在蛋白水平检测CONPs对肾癌细胞蛋白质翻译有何影响,shRNA干扰靶蛋白寻找并验证CONPs的靶点。3、透射电子显微镜观察CONPs作用于肾癌细胞器的亚细胞结构,细胞内铜离子含量通过电感耦合等离子体质谱法的铜总量吸收实验所测定,通过对肾癌细胞内ROS和钙离子浓度的检测来检验细胞内氧化活性反应和内质网应激通路的激活。4、裸鼠皮下成瘤在体实验验证CONPs在动物体内是否能发挥抗肾癌效应。取裸鼠皮下瘤体标本TUNEL和KI67实验,进一步在体内实验中验证CONPs对肾癌增殖和凋亡的影响。四、结果:1、CONPs对肾癌细胞生长产生抑制,并且阻滞肾癌细胞周期于S和G2期。同时,CONPs抑制了肾癌细胞的侵袭和转移。2、透射电子显微镜观察到CONPs使肾癌细胞内质网肿胀,并且用流式细胞技术也检测到CONPs使肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度显著提高,并且与用药浓度和用药时间正相关,ROS水平和钙离子浓度的上升都是内质网应激的使动因素。3、CONPs诱导细胞内铜离子积聚,并且靶向作用铜伴侣蛋白发挥抗肿瘤效应。CONPs诱导肾癌细胞内质网应激并促进其细胞凋亡,WB实验验证了内质网通路和凋亡通路上关键蛋白的激活。4、CONPs在体内动物模型实验中抑制裸鼠皮下肾癌瘤体的生长。并且靶向AXL和MET蛋白,恢复肾癌耐药细胞对舒尼替尼的敏感性,体内实验的瘤体也同时验证内质网和凋亡通路的激活,以及对耐药蛋白的抑制。五、结论:我们系统性了CONPs的药理学效应,以及无机纳米药物在抑制肾癌和耐药肾癌模型的进展,多项研究表明CONPs在体内和体外实验中抑制了肾癌的生长。并且我们研究了CONPs作用于铜伴侣蛋白ATOX1和CCS的药理学效应。我们发现CONPs可以显著影响ATOX1和CCS的功能,干扰细胞内铜转运,并且释放铜元素,导致细胞内铜元素累积,CONPs提高肾癌细胞内ROS水平和钙离子浓度,从而导致内质网应激的发生,并在抑制其增殖的同时促进凋亡。CONPs在抗肾癌细胞的同时显示了极低的肝肾毒性,并且通过下调AXL、MET、AKT、ERK来抑制舒尼替尼耐药。这些研究都可以说明CONPs值得开发为新型抗肿瘤纳米药物从而应用到对进展期肾癌和舒尼替尼耐药肾癌的临床治疗中,这样可以极大程度上促进中晚期肾癌患者的预后。