细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是葡糖醋杆菌分泌合成的一种胞外多糖。作为新型生物纳米材料,已成为微生物合成材料的研究热点之一,广泛应用于各个领域。然而,葡糖醋杆菌在合成BC过程中会产生大量葡萄糖酸、乙酸等代谢副产物,形成的酸胁迫环境影响菌体的生长和存活,进而影响BC的合成。因此,理解酸胁迫下生存和适应机制对基础研究和应用方面都有重要意义。本论文主要从葡糖醋杆菌的谷胱甘肽途径抗氧化,细胞膜脂肪酸的代谢适应性,乙醛酸循环代偿途径三个方面阐释葡糖醋杆菌耐酸适应性机理。同时采用DES结合60Co-γ复合诱变,结合质子自杀法筛选低酸高产细菌纤维素突变株。为后续细菌纤维素高产合成的代谢工程提供科学依据,BC产量的提高也将有助于其工业化生存和推广的快速开展。主要研究结果如下:酸胁迫导致ROS过度积累,ATP过度消耗,H+-ATPase活性降低,加剧了胞内H+的损害,进而导致菌体存活率下降;过度酸胁迫导致总谷胱甘肽和GSH均降低,GSSG增加,GSH/GSSG显著降低。酶学分析表明GSH酶活性依然高效表达,但将GSSG转变为GSH的关键酶GR活性显著被抑制。同时这种转变所需的NADPH还原力也被大量消耗。表明酸胁迫下,菌体部分死亡可能是由于氧化还原平衡受损所致。酸胁迫下,NADP-GDH酶活性高效表达,催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应,同时生成NADPH、ATP,表明在严重酸胁迫下,菌体通过谷氨酸分解代谢提供能量和还原力抵抗氧化应激。比较了酸胁迫下葡糖醋杆菌细胞膜流动性及脂肪酸变化规律。结果表明,酸胁迫导致葡糖醋杆菌细胞膜流动性下降,脂不饱和脂肪酸增加,不饱和度上升,链长增加。同时发酵过程中,随着pH逐渐降低,饱和脂肪酸降低,不饱和脂肪酸增加,特别是C18-1w9c、C19-Cyc的增加。RT-PCR结果表明des和cfa基因在酸胁迫条件下被激活。外源添加剂实验结果表明脂肪酸合成参与调节细胞膜脂肪酸结构组成的改变,同时这种调节存在反馈抑制,抑制脂肪酸合成会增强葡糖醋杆菌对酸胁迫的敏感性,导致存活率降低。结果表明葡糖醋杆菌的调节细胞膜脂肪酸的转变是其耐酸存活的一种生存机制,而脂肪酸合成过程参加调节这种脂肪酸转变,改善葡糖醋杆菌的耐酸适应性。酸胁迫条件下G6PDH和IDH等酶活降低,导致PPP途径和TCA途径代谢受阻,NADPH合成降低。乙醛酸循环途径关键酶ICL、MS酶活性显著增加。与此对应,乙醛酸循环产物苹果酸和琥珀酸,以及作为抗氧化剂的α-酮戊二酸显著增加,而丙酮酸和柠檬酸积累降低。基因表达数据表明酸胁迫激活了应激蛋白,aatA、grpE、dnaK、dnaJ的表达。表明在酸胁迫下,葡糖醋杆菌的乙醛酸循环途径作为代偿途径,在对TCA,糖异生的回补和能量供应方面发挥重要作用,同时生成的α-酮戊二酸以及菌体的应激蛋白参与抵抗酸胁迫下的氧化应激,保障了葡糖醋杆菌在酸胁迫下的存活。运用DES化学诱变和60Co-γ复合诱变,结合质子自杀法获得了产酸少的细菌纤维素高产菌株Br-3和Co-5,以及一株低产突变株Br-12。运用AFLP对突变菌株进行基因多态性分析,并对其中比较显著的5个差异片段进行测序发现,Br-12突变株的3个差异基因片段分别对应着编码合成TonB依赖性受体蛋白、胞外多糖输出蛋白(PePr)和假定蛋白基因序列高度同源;而突变株Co-5的两条差异基因片段中一条与acsD基因同源,另一条对应着UDPG差向异构酶。对突变菌株的代谢分析表明,葡萄糖酸对细菌纤维素的产量影响较大,这也同时表明基因差异可直接影响菌体代谢及产物产量,而代谢结合基因信息也可以快速筛选和鉴定相应的突变体。