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高致病性禽流感(HPAI)是由特定亚型的A型流感病毒引起的禽类急性高度致死性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疾病。HPAI以高发病率和高死亡率为特征,常对疫区畜禽业造成毁灭性打击,严重影响国际贸易。对HPAI的控制主要采用隔离封锁疫点、扑杀销毁感染动物和受威胁动物以及其它生物安全措施,但是在疫情波及范围很大,扑杀感染动物很难实施时,用疫苗免疫控制疫情则是不可替代的措施。目前应用的HPAI疫苗主要是油乳剂全病毒灭活疫苗,它具有保护率高,免疫期长和研制周期短等优点。但灭活疫苗也存在一些难以克服的缺陷,如影响疫情监测,制备和使用中存在散毒风险,生产成本高等。因此,开发可克服上述缺陷的新型疫苗已迫在眉睫。本研究利用自主开发的鸡痘病毒表达系统,构建了可稳定表达禽流感病毒血凝素基因(HA)的重组鸡痘病毒,以及可分泌表达HA基因,嵌合表达产单核细胞李斯特杆菌溶血素(LLO)基因的重组鸡痘病毒,并在SPF鸡,商品鸡上开展免疫保护试验,为HPAI的防制提供新的疫苗储备。 一 高效表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建 对含H5病毒A/Chicken/Huadong╱1/00的鸡胚尿囊液利用试剂盒提取病毒基因组总RNA,进行RT-PCR扩增HA基因,克隆入pGEM-T easy载体后进行测序,得到中间载体pT-H5A。将质粒pT-H5A用BamHI酶切,回收纯化1.7kb HA基因,亚克隆入经BamHI酶切并去磷酸化的高效表达插入载体pP12LS中Ps启动子下游,得到重组转移载体pP12LS-HA,利用转染试剂Genegemmer介导的方法转染由亲本禽痘病毒282E4感染的鸡胚成纤维细胞。经蓝斑筛选、纯化重组病毒,间接免疫荧光试验鉴定,得到高效表达HA基因的重组病毒rFPV-12LS-HA。 二 分泌表达H5亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒及嵌合表达H5亚型AIVHA基因和LLO基因的重组鸡痘病毒的构建 1 分泌表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建扬州大学硕士学位论文 通过DNA star生物学分析软件分析HA基因,利用特异性引物扩增具有免疫原性而去除膜结合部分的HA基因(命名为HAA基因),克隆入pCR2.1载体后测序,得到pCR2.1一HAA。将质粒pcR2.1一HAA用BamHI酶切,回收纯化1 .skb HAA基因,插入到经刀口用HI酶切并去磷酸化的高效表达插入载体PP12LS中得到转移载体pP 1 ZLS一HAA,按Genege~er介导的方法转染由亲本禽痘病毒LPv感染的鸡胚成纤维细胞。经蓝斑筛选、纯化重组病毒,间接免疫荧光试验鉴定,得到表达HAA基因的重组病毒rFPV- 1 ZLS一HAA。2嵌合表达HS亚型禽流感病毒HAA基因及LLO基因的重组鸡痘病毒的构建 根据大引物PCR法扩增HAA+LLOd123基因,HAA+LLOd4基因(分别命名为HAB,HAC基因),克隆入pCR2.1载体并测序。将质粒pCR2.1.HAB,pCR2.卜HAC分别用BamHI酶切,回收2.gkb HAB、2.3kb HAC基因,插入到经Ba加HI酶切并去磷酸化的高效表达插入载体pP 12LS中得到转移载体pP 1 ZLS一HAB,pp 12Ls·HAC,按Genegemmer介导的方法转染由亲本禽痘病毒LpV感染的鸡胚成纤维细胞。经蓝斑筛选、纯化重组病毒,间接免疫荧光试验鉴定,得到重组病毒rFPV-12LS~HAB,rFPV-12LS一HAC。三重组鸡痘病毒rFPV- 1 ZLS~HA,rFPV- 1 ZLS一HAA,rFPV-12LS.HAB,rFPV- 1 ZLS一HAC的免疫效力试验 利用上述四种重组鸡痘病毒疫苗分别免疫SPF鸡和有母源抗体商品鸡,通过检测免疫后Hl抗体水平,攻毒后发病率与死亡率等指标评价疫苗的免疫保护效力,确定重组疫苗的有效免疫剂量,探讨母源抗体对重组疫苗主动免疫的影响,抗原定位对免疫保护效力的影响,以及LLO作为免疫佐剂的应用前景,比较重组疫苗与灭活苗免疫效力的差异。1重组鸡痘病毒疫苗的免疫效力实验 用亦Pv- 1 ZLS一HA(1 03PFu~2 05PFu),正P琴12Ls一HAA分别免疫l日龄SPF鸡,免疫后21天攻毒,rFPV-12LS.HA,rFPV-12LS.HAA都能提供100%的保护。其中,rFPv- 1 ZLS.HA从lo3PFu到105PFu免疫剂量俱能提供完全保护,达到灭活苗水平,为制备价格低廉的重组病毒疫苗奠定了基础。其中,IOSPFU组在各组中的Hl抗体阳性率最高,表明增加免疫剂量可促进HI抗体应答。2母源抗体对重组鸡痘病毒疫苗主动免疫的影响 用rFPv- 1 ZLs一HA(1夕PFU~1 O6PFu)免疫7日龄有母源抗体的商品鸡,免疫后21天IO3PFU到106PFU免疫组均未检测出Hl抗体,表明母源抗体完全抑制