P450芳香化酶在硬骨鱼类的性别分化和性腺发育过程中,扮演着尤为重要的角色。芳香化酶将睾酮转化为雌二醇,调控性腺分化和维持卵巢的发育。硬骨鱼类的P450芳香化酶主要由两种:性腺型和脑型,分别由Cyp19a1a和Cyp19a1b两个基因编码。对于雌雄同体的性反转鱼类而言,芳香化酶基因活性的强弱决定了性腺发育的方向。启动子是芳香化酶基因表达的主要调节因子,启动子上的作用元件可以与特定的转录因子相结合,以此来启动和调控Cyp19a1a基因的表达。本研究选择具有代表性的雌雄同体鱼类波纹唇鱼为研究对象,研究了波纹唇鱼Cyp19a1a基因启动子上的雄激素和雌激素的应答区域及应答元件。主要结果如下:1.采用基因组步移技术,成功克隆得到波纹唇鱼Cyp19a1a基因启动子的序列,共1444 bp。分析发现,其序列上含有5个1/2雄激素反应元件(ARE)和4个1/2雌激素反应元件(ERE)。2.采用双荧光素酶检测系统构建启动子重组载体,再转染入HEK-293T、COS-7、LβT、CHO-K2、U251-MG以及TM4等细胞株中。检测结果显示:HEK-293T细胞株在表达Cyp19a1a启动子活性上效果最好。在HEK-293T细胞株中,当浓度范围在10-9 M-10-5M内时,睾酮可以通过AR显著上调Cyp19a1a启动子的活性;当浓度范围在10-9M-10-5M内时,雌二醇均能上调Cyp19a1a启动子的活性,在10-6M浓度下,Cyp19a1a启动子活性最高。3.采用启动子删减技术构建Cyp19a1a启动子的删减载体。根据ARE和ERE元件位置,共构建雄激素删减载体5个,雌激素删减载体3个,并研究他们在HEK-293T细胞中分别被性激素刺激后启动子的活性变化。实验结果显示,启动子删减第一个ARE时,睾酮对其活性的调控作用骤减;依次删减其余AREs,依然可以保持活性。ARE全部删减导致启动子丧失活性。雌二醇诱导实验中,启动子删减第一个ERE,其活性就降至对照组水平。删减其余ERE,对启动子活性没有影响。4.采用融合PCR技术对波纹唇鱼Cyp19a1a启动子上的2个1/2 ARE位点(即1/2ARE#1,1/2ARE#2)和1/2ERE#1位点进行突变。结果显示,睾酮诱导实验中,2个1/2ARE位点的突变均导致启动子活性显著降低。1/2ERE#1位点的突变,导致启动子对雌二醇调控活性丧失。本研究证明,睾酮及雌二醇均能对波纹唇鱼芳香化酶基因Cyp19a1a启动子进行调控。存在2个ARE位点具备睾酮调节活性,而仅有ERE#1元件具备雌二醇调控活性。本研究为揭示波纹唇鱼P450芳香化酶基因表达调控规律提供了理论支持。