P450芳香化酶是脊椎动物重要的性激素调节酶类,其在性别分化、生殖调控等方面发挥重要作用。多数硬骨鱼中存在性腺型和脑型两种芳香化酶,这两种酶分别由cyp19a1a和cyp19a1b基因编码,在鱼类的性别发育中发挥不同的作用。波纹唇鱼是雌雄同体的社会性性反转鱼类,其性激素调节机制尚不清楚。本文开展波纹唇鱼脑型芳香化酶基因启动子的活性研究,揭示性激素对于cyp19a1b基因启动子的调节机制。1.采用Genome walking技术对本实验室已获得的cyp19a1b基因启动子进一步扩增,得到了全长约为2.3kb的cyp19a1b基因启动子序列,用转录因子结合位点(TFBS)在线软件对该序列进行分析,结果表明cyp19a1b基因启动子上存在多种转录调控元件,如4个AREs,1个完整的ERE,1个1/2ERE,还包括SP1,AP-1,cAMP反应元件(CRE)等。2.将cyp19a1b启动子与PGL-4载体双酶切后连接,构建双荧光素酶报告基因载体。随后将其分别与构建完成的雌激素受体(ER)真核表达载体、雄激素受体(AR)真核表达载体共转染至HEK-293T细胞系,再分别用不同浓度的雌二醇(E2)、睾酮(T)做刺激处理。采用双荧光素酶检测系统进行检测。结果显示,当E2浓度范围在10-9M-10-6M时,其可以通过ER上调cyp19a1b启动子的活性,且E2浓度为10-6M时,cyp19a1b启动子活性最高;当T浓度范围在10-9M-10-5M时,其同样可以上调cyp19a1b启动子的活性,且T在10-5 M时,cyp19a1b启动子活性最高。3.为进一步研究雌二醇、睾酮与cyp19a1b启动子反应区域,本研究根据ARE和ERE元件位置共构建了雌激素删减载体2个,雄激素删减载体4个,并研究它们被雌二醇、睾酮刺激后的活性变化。结果显示,当删减了cyp19a1b启动子上ERE调控元件时,该启动子活性反应消失,而删减了 1/2ERE元件的cyp19a1b启动子活性未消失。这说明ERE元件显著调控cyp19a1b基因表达;当逐一删减了cyp19a1 启动子上ARE元件时,该启动子活性逐渐降低。4.采用融合PCR技术对波纹唇鱼cyp19a1b启动子上的ERE元件以及4个ARE元件(即ARE#1,ARE#2,ARE#3,ARE#4)进行突变。结果显示,当突变了ERE元件时,cyp19a1b启动子活性反应完全消失;当突变了该启动子上ARE#1,ARE#3,ARE#4元件时,启动子活性均有不同程度下降,且突变了 ARE#3,ARE#4位点的启动子活性下降较为明显。而突变ARE#2元件的启动子活性与未突变的启动子活性没有差异。这些结果表明ERE元件对cyp19a1b启动子活性影响显著,ARE#3、ARE#4两个调控位点在cyp19a1b基因启动子调控上起主要作用。本研究结果证明了雌、雄激素均能对波纹唇鱼cyp19a1b基因启动子进行调控。揭示了雌雄激素对波纹唇鱼芳香化酶基因表达的影响,为进一步洞悉芳香化酶表达的调控机制奠定分子基础。