研究背景及目的:食管癌在我国的消化系统肿瘤中占有重要的比例,河南省是食管癌的高发地区。食管癌在早期不易被发现,大多数患者确诊时已属晚期阶段,肿瘤的进展快,容易发生转移。在我国的食管癌患者中,主要的病理类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。随着医疗事业的发展,食管癌的治疗效果已取得了相当大的进步,但是仍有大部分的患者在治疗后出现复发或转移的情况,患者的生存期并未出现明显的改善,治疗效果不佳。因此寻找新的食管癌的治疗途径就显得尤为重要。随着近几年分子生物学技术的发展,肿瘤相关基因研究的深入,基因治疗及分子靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗的新方向,而在这之中重要的是如何选择特异性的分子靶点。L1细胞粘附分子(L1 Cell Adhesion Molecule,L1CAM)属于细胞粘附分子免疫球蛋白超家族。在研究的初始阶段,L1CAM分子被发现是在神经系统发育过程中起到重要的作用。后来发现它在肿瘤中也出现有异常的表达,包括在卵巢癌,恶性黑色素瘤,乳腺癌,前列腺癌,子宫内膜癌中,并且认为L1CAM与患者预后差和疾病的终末阶段相关,提示L1CAM是一个促进肿瘤进展的基因。L1CAM作为靶向治疗的靶点具有很多优势,首先这是一个在肿瘤进程中很重要的分子,促进了肿瘤细胞的运动,侵袭和转移;在卵巢癌或者胰腺癌等多种肿瘤中高表达,可用于传统化疗疗效不佳,预后差的患者;具有组织选择性,L1CAM一般表达于成人器官的外周神经和肾小管细胞。然而目前L1CAM在食管鳞癌中的表达情况还属未知,在食管癌进展中的作用还不清楚。本文通过对L1CAM在食管鳞癌中的表达及预后的关系进行分析,了解L1CAM在食管鳞癌中的表达及作用,跟患者的临床参数相关性如何,和食管癌的发生发展关系怎样,抑制L1CAM的表达能否抑制食管鳞癌细胞的增殖,侵袭及运动能力,在动物模型中验证,并对L1CAM的相关机制进行研究。第一部分L1CAM在食管鳞癌患者中的表达及与患者临床参数的分析方法1)用Real time PCR的方法检测食管癌患者癌和癌旁正常食管黏膜组织中L1CAM的表达。2)分析L1CAM m RNA表达水平与患者临床病例参数之间的关系。3)用免疫组化的方法检测食管癌患者癌组织中L1CAM蛋白的表达。4)分析L1CAM蛋白表达水平与患者临床病例参数之间的关系。5)L1CAM蛋白表达与食管癌患者预后的相关性分析。结果1)117对食管癌患者的癌组织中L1CAM m RNA的表达显著高于癌旁正常食管粘膜组织,P<0.01,癌中L1CAM表达水平高于癌旁两倍以上的病例占56.41%。2)L1CAM m RNA的表达水平与患者肿瘤的分化程度、侵袭程度和肿瘤的临床分期具有显著相关性,P<0.05。3)69例食管癌患者肿瘤组织中L1CAM蛋白的阳性表达率为78.26%。4)L1CAM蛋白的表达水平与患者肿瘤侵袭程度、分化程度、肿瘤的分期及患者的生存显著相关,P<0.05。5)L1CAM蛋白高表达组的患者的总生存率显著低于L1CAM低表达组患者,P<0.05。小结1)在食管癌患者的癌组织中L1CAM m RNA的表达显著高于癌旁正常组织,m RNA及蛋白的表达水平与患者的临床病理参数相关。提示L1CAM可能在食管癌的发生发展中起到重要的作用。2)L1CAM蛋白的表达与患者的生存期显著相关,提示L1CAM可能是判断食管癌患者预后的一个指标。第二部分L1CAM的表达对食管癌细胞系TE1和EC1生物学行为的影响方法1)用Real time PCR的方法检测L1CAM在多种食管癌细胞系及正常食管永生化细胞中的表达水平。2)构建L1CAM稳定低表达的sh RNA慢病毒感染的TE1和EC1细胞。3)CCK8的方法检测L1CAM表达的下调对食管癌TE1和EC1细胞增殖的影响。4)流式细胞术检测L1CAM表达下调对食管癌细胞周期和凋亡的影响。5)在低粘附板中观察L1CAM表达下调对食管癌细胞成球能力的影响。6)Transwell系统观察L1CAM表达下调对食管癌细胞迁移和侵袭能力的影响。7)建立裸鼠移植瘤模型,观察L1CAM表达下调对裸鼠移植瘤生长的影响。结果1)L1CAM在食管癌细胞TE1和EC1中表达相对较高,选择这两个细胞系构建L1CAM稳定低表达的食管癌细胞。2)用Real time PCR和Wester blot的方法验证L1CAM敲低的效率,即L1CAM在m RNA及蛋白水平表达降低。3)L1CAM表达的降低能够抑制食管癌细胞的增殖。4)L1CAM表达的降低能够阻滞食管癌细胞的周期于G0/G1期,并且使肿瘤细胞的凋亡增加。5)L1CAM表达的降低能够抑制食管癌细胞的成球能力。6)L1CAM表达的降低能够使肿瘤细胞迁移和侵袭的能力减弱。7)在裸鼠移植瘤模型中,L1CAM的表达降低使裸鼠肿瘤的形成能力减弱,形成肿瘤的体积和质量均减小。小结1)L1CAM表达降低,能够降低食管癌细胞的增殖及自我更新能力,阻滞细胞周期,降低食管癌细胞迁移和侵袭能力,提示L1CAM在食管癌的恶性行为中起到了重要的作用。2)L1CAM表达降低,在裸鼠动物模型中发挥抑制肿瘤的形成和发展的作用。第三部分L1CAM通过调控NF-kB的活性促进调节性T细胞的招募方法1)细胞因子微球检测技术分析L1CAM敲低以后食管癌细胞上清中细胞因子的变化,选出变化差异最大的因子,并用ELISA及Real time PCR进行验证。2)体外Transwell系统中检测L1CAM表达降低以后对健康人外周血CD4+FOXP3+Treg细胞的招募作用的变化。3)在裸鼠移植瘤模型中给裸鼠注射健康人外周血CD4+T细胞,验证L1CAM表达降低对Treg细胞的招募作用的变化。4)Real time PCR和免疫组化的方法检测裸鼠肿瘤部位L1CAM、CCL22、FOXP3和CCR4的表达。5)Western blot的方法检测L1CAM表达降低后对NF-kB活性的影响,并用ELISA及Real time PCR检测用NF-kB抑制剂处理以后的TE1细胞CCL22的表达水平。6)用Real time PCR和流式细胞术的方法检测和分析食管癌患者肿瘤组织中L1CAM m RNA的表达水平与肿瘤组织中Treg细胞的数量的相关性。7)用Kaplan–Meier生存曲线分析食管癌患者肿瘤组织中CD4+FOXP3+Treg细胞所占比例与患者预后的相关性。结果1)随着L1CAM表达的降低,TE1细胞上清中CCL22的表达变化最明显,呈显著降低。2)在体外试验中,L1CAM表达降低使CCL22表达下调,从而使招募到肿瘤细胞部位的Treg细胞的数量明显减少。3)体内的动物实验中,流式细胞术的检测结果表明,随着L1CAM表达的降低,趋化到肿瘤部位的Treg细胞明显减少。4)在体内试验中,L1CAM表达降低,使肿瘤部位CCL22、FOXP3、CCR4的m RNA及蛋白水平表达降低。5)L1CAM表达降低可以抑制NF-kB的活性;使用NF-kB抑制剂处理肿瘤细胞TE1后,肿瘤细胞分泌CCL22的水平降低。6)肿瘤患者癌组织中L1CAM m RNA的表达与Treg细胞的数量呈正相关,P<0.05。7)食管癌患者肿瘤组织中Treg细胞所占越高,患者的预后越差。小结1)在食管癌细胞TE1中随着L1CAM表达降低,TE1细胞表达的CCL22的水平降低,从而使招募的Treg细胞的数量减少。2)在患者的肿瘤组织中L1CAM的表达与患者肿瘤组织中浸润的Treg细胞的数量呈正相关,并且Treg细胞的数量与患者预后具有相关性。3)L1CAM通过调节NF-kB的活性来调节CCL22的表达。结论1)L1CAM在食管癌患者的肿瘤组织中表达显著升高,并且与患者的临床病理参数及预后相关,说明L1CAM在食管癌的发生发展中具有重要的作用。2)L1CAM的表达降低能够降低食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力,阻滞细胞周期、增加肿瘤细胞的凋亡。3)L1CAM的表达降低能够下调食管癌细胞CCL22的表达,从而使招募到肿瘤部位的Treg细胞减少,这一作用是通过降低NF-?B的活性来实现的。