研究背景肺癌是对人类生命和健康威胁最大的恶性肿瘤之一,在世界范围内其发病率和死亡率均已跃居至癌症的首位。其中80%的肺癌为非小细胞肺癌,而作为非小细胞肺癌最主要的组织类型之一,肺腺癌的发病率在世界范围内逐年上升并已超过肺鳞癌。肺腺癌具有明显的临床、影像、组织学和分子异质性,经多年研究对肺腺癌的认识从肿瘤发生到治疗等多方面都有显著进展,但它仍是最常见的致死性肿瘤之一,生存率无显著提高。目前判断肺腺癌预后的主要依据仍是肿瘤的TNM分期,但临床观察和随访发现相同分期的肿瘤,预后也会存在很大差别。近年来,随着对恶性肿瘤分子机制的深入研究和分子生物、生物信息技术的快速发展,不同个体遗传差异对肿瘤发生、发展、预后及治疗敏感性等肿瘤生物学行为的影响被逐渐揭示。因此,寻找能够评估和预警肺腺癌尤其是早期阶段术后复发和转移相关的临床病理乃至分子特征,成为目前肺腺癌基础研究和临床实践的研究热点。值得注意的是,胸水是肺腺癌患者最常见伴发的临床症状之一。早期积液量较少时,患者可能无症状,晚期随着积液量的增加患者常有呼吸困难、咳嗽等症状,生活质量明显下降。肺腺癌患者一旦出现恶性胸腔积液,即意味着病变已到晚期,平均生存期只有4个月。故胸水腺癌的诊断对患者治疗和预后尤为重要。然而,由于部分出现胸水患者原发灶不明、肿瘤细胞的不典型性、病理医生的诊断水平或者细胞制片等因素,单独依靠形态学来鉴别所有的转移性腺癌(metastatic adenocarcinoma, MAC)和反应性间皮细胞(reactive mesothelialcells,RMs)往往存在困难。胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白-3(Insulin-like growth factor II mRNA-binding protein 3, IMP3)是胰岛素样生长因子信使RNA结合蛋白家族(IMP1、INP2、IMP3)的成员之一,该家族在胚胎形成早期能高度特异性的结合信使RNA,在RNA运输稳定细胞增殖和迁移中起着重要的作用。研究证实IMP3广泛表达于人类各种恶性肿瘤,其中包括胰腺癌、食管癌、恶性黑色素瘤、胃肠道肿瘤、泌尿道肿瘤、生殖系统肿瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、肝胆道肿瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤等,被公认为一种癌胚蛋白,与肿瘤的增殖、侵袭、进展、转移和预后不良密切相关。IMP家族成员通过调节黏附分子包括CD24、CD44、细胞黏附分子(ALCAM、SynCA、MCAM)和基质金属蛋白酶1促进癌细胞黏附,形成树突状伪足,而出现侵袭作用。有关IMP3在肺腺癌中的研究报道较少,已有的研究结果认为IMP3的表达与肺腺癌的组织学分化、组织学亚型及远处转移有关。而这些研究基本以临床标本免疫组化检测为主,均未进行生存期分析,IMP3表达与肺腺癌细胞侵袭性的相关性也缺少细胞水平的进一步验证。另外,有关IMP3在胸水间皮细胞增生与腺癌的鉴别诊断意义的研究鲜有报道。而IMP3在胸水肺来源腺癌(metastatic adenocarcinoma of lung origin, LAC)和其他组织来源腺癌(metastatic adenocarcinoma of non-lung origin, NLAC)的鉴别是否有意义仍不清楚。目的1.观测IMP3在含有95例肺腺癌和75癌旁组织的组织芯片的表达,并对其临床病理特征和生存资料进行统计学分析；2.构建稳定干扰IMP3基因的慢病毒载体转染肺腺癌细胞,检测沉默IMP3基因对肺腺癌细胞侵袭和增殖能力的变化；3.探究联合IMP3、CK5/6和TTF1指标在胸水RMs、恶性间皮瘤(malignant mesothelioma, MM)、LAC和NLAC的鉴别诊断意义。方法1.IMP3表达与肺腺癌患者临床病理特征和预后的关系采用免疫组化方法检测IMP3在95例肺腺癌和75癌旁组织的组织芯片的表达,IMP3表达的结果分为阴性与阳性两组,分析IMP3表达与各肺腺癌临床病理参数的关系并进行生存分析。2.沉默IMP3基因对肺腺癌细胞侵袭能力和增殖的影响(1)IMP3在肺腺癌细胞株的表达运用Real-time PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测IMP3在肺腺癌细胞株(A549, GLC-82, H358, H322和SPC-A1)和永生化支气管上皮细胞16HBE中的表达；然后利用免疫细胞化学技术检测IMP3在肺腺癌细胞A549和H322中的表达定位情况。(2)稳定干扰IMP3的肺腺癌细胞亚系A549-shIMP3和H322-shIMP3的构建含IMP3-shRNA干扰片段的慢病毒表达载体购自上海吉凯公司；将含慢病毒载体(实验组,对照组)的病毒上清分别转染肺腺癌细胞株A549和H322,实验组命名为A549-shIMP3和H322-shIMP3,对照组命名为A549-control和H322-control,两组均含有GFP。利用流式细胞技术根据GFP的表达筛选出阳性细胞；对新构建的细胞亚系,通过Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。(3)检测沉默IMP3对肺腺癌细胞侵袭能力和增殖的影响Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,CCK8和流式细胞技术检测细胞增殖情况。3.联合运用IMP3、CK5/6和TTF1观测胸水RMs、LAC和NLAC的鉴别诊断意义对收集的胸水标本做成细胞蜡块,运用免疫细胞化学和普通PCR技术检测CK5/6、IMP3和TTF1在32例胸水RMs、51例LAC和25例NLAC标本中的表达。4.统计方法采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示,组间比较采用计数资料的χ2检验。使用Log-Rank法进行单因素生存分析,绘制Kaplan-Meier生存曲线,多因素生存分析采用Cox回归。Real-time PCR结果用单向方差分析(one-way ANOVA),流式检测分析结果用两独立样本t检验,Transwell和CCK8分析结果用析因设计资料的方差分析。按P<0.05,差异具有统计学意义。结果1.IMP3表达与肺腺癌患者临床病理特征和预后的关系IMP3表达主要定位于肺腺癌肿瘤组织的细胞质,在癌旁组织不表达；腺癌组织中阴性组为56例,阳性组为39例。IMP3表达在肺腺癌高、中和低分化程度的阳性率分别为19.0%(4/21)、42.6%(20/47)和55.6%(15/27),差异具有统计学意义(P=0.037)。IMP3表达与肺腺癌TNM分期有关(P=0.034),在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ分期表达阳性率分别为32.7%(16/49)、28.6%(4/14)和59.4%(19/32),即分期越晚,IMP3表达阳性率越高。有淋巴结转移的肺腺癌患者的IMP3表达阳性率较无淋巴结转移者更高,分别是56.4%(22/38)和30.4%(17/56)(P=0.011)。 IMP3表达与肺腺癌患者的年龄(P=0.659)、性别(P=0.785)和肿瘤大小(P=0.489)无关。95例肺腺癌患者总体五年生存率为54.7%,生存时间中位数是62.95月。对IMP3表达和各临床病理参数均进行Kaplan-Meier单因素生存分析,结果显示IMP3表达(P=0.000)、TNM分期(P=0.000)和有无淋巴结转移(P=0.001)等因素对生存时间的影响均具有统计学差异,而肺腺癌患者年龄(P=0.141)、性别(P=0.624)、肿瘤最大径(P=0.693)和分化程度(P=0.177)对生存时间的影响无统计学差异。将IMP3表达和各临床病理参数均纳入到Cox回归分析,观察其是否可以作为肺腺癌患者预后的独立影响因素。单变量分析结果显示,TNM分期(P=0.000),淋巴结转移(0.002)和IMP3表达(P=0.000)与患者预后相关；但将这些临床病理参数均纳入到Cox回归多变量分析,结果却发现只有TNM分期(HR,2.338; 95% CI:1.393-3.925; P=0.001)和IMP3表达(HR, 2.310; 95% CI:1.192-4.476; P=0.013)与预后相关,可以作为肺腺癌患者预后的独立影响因素,而其余临床病理参数均不能作为预后的独立影响因素。2.沉默IMP3基因对肺腺癌细胞侵袭能力和增殖的影响(1)IMP3在各肺腺癌细胞株的表达Real-time PCR结果显示IMP3在6株细胞的表达有差异(P=0.001)；经两两比较发现,其中有4株肺腺癌细胞中的IMP3表达量比16HBE更高(P<0.05),另外H358表达比16HBE略低,但是差异无统计学意义(P>0.05)。 Western blot进一步显示IMP3在这些肺腺癌细胞株中高表达,而16HBE表达相对较低。ICC检测了IMP3在肺腺癌细胞A549和H322中的表达,结果显示IMP3表达主要定位于肺腺癌细胞株的细胞质,和第一部分肺腺癌组织表达一致。(2)稳定干扰IMP3的肺腺癌细胞亚系A549-shIMP3和H322-shIMP3的构建将载有IMP3基因的shRNA干扰片段的慢病毒载体和空载体分别转染A549和H322细胞,运用流式细胞技术检测转染率并筛选出GFP+的细胞。Real-timePCR和Western blot检测转染并筛选后IMP3干扰效率。结果显示,转染后实验组A549-shIMP3 (P=0.000)和H322-shIMP3 (P=0.000)的IMP3表达在mRNA和蛋白水平都明显下调,而对照组A549-control和H322-control变化不明显。(3)检测沉默IMP3基因对肺腺癌细胞侵袭能力和增殖的影响Transwell小室迁移实验检测各组细胞在shRNA处理下在6h、24h和48h体外迁移、侵袭能力的变化。上室为100μl细胞悬液,下室为500μl含10%胎牛血清的完全培养基。经析因设计资料的方差分析结果显示A549-shIMP3的穿膜细胞数显著少于A549-control; H322-shIMP3的穿膜细胞数显著少于H322-control,不同组别间差异具有显著性(F=196.46, P=0.000; F=166.74, P=0.000);不同时间组对穿膜细胞数的影响差异具有显著性(F=1033.97, P=0.000; F=1113.20,P=0.000);细胞组别和时间因素的交互效应显著(F=52.39,P=0.000; F=60.81, P=0.000)。两组细胞经两独立样本t检验显示在同一时间点除第6h外,第24h和48h两组细胞的穿膜细胞数均有显著差异,A549-shIMP3的穿膜细胞数显著少于A549-control (P<0.05), H322-shIMP3的穿膜细胞数显著少于H322-control (P＜0.05)。 CCK8法检测A549-control、A549-shIMP3和H322-control、 H322-shIMP3的增殖情况,经析因设计资料的方差分析结果显示A549-SiIMP3的增殖能力显著低于A549-control, H322-shIMP3的增殖能力显著低于H322-control,不同组别间差异具有显著性(F=66.033, P=0.000 ; F=57.487,P=0.000);不同时间组对细胞体外增殖能力的影响差异具有显著性(F=103.805, P=0.000; F=274.488,P=0.000);细胞组别和时间因素的交互效应显著 (F=7.858,P=0.000; F=5.756, P=0.000)。两组细胞经两样本t检验显示,A549组细胞在第一天和第四天外,第二天到第七天两组细胞的增殖能力均有显著差异,A549-shIMP3的增殖能力显著低于A549-control (P＜0.05); H322组细胞中,除了第1,2和4d, H322-shIMP3的增殖能力显著低于H322-control (P<0.05)。流式细胞技仪检测细胞周期分布。结果显示,与对照组相比,下调IMP3基因后,实验组A549-shIMP3和H322-shIMP3细胞的G1期细胞比率增加,而S期细胞比率减少。3.联合运用IMP3、CK5/6和TTF1观测胸水RMs、LAC和NLAC的鉴别诊断意义(1)运用ICC方法检测CK5/6、IMP3和TTF1在32例胸水RMs和76例MAC细胞中的表达结果显示,CK5/6和IMP3主要表达定位于细胞质,而TTF1主要表达定位于细胞核。CK5/6在胸水RMs表达阳性率明显高于MAC (78.1% VS 14.5%, P=0.000);IMP3在MAC表达阳性率明显高于RMs (88.2% VS 9.4%, P=0.000);另外,在MAC标本中,我们比较了IMP3与TTF1的表达情况,IMP3表达阳性率明显高于TTFl (88.2% VS 52.6%, P=0.000)。同时,我们比较了IMP3和TTF1分别在LAC和NLAC的表达情况,结果发现IMP3在LAC和NLAC表达差异无统计学意义(88.2%VS 88.0%,P>0.05),而TTF1在LAC表达阳性率明显高于NLAC(76.5%VS 4.0%,P=0.000)。(2)联合运用CK5/6和IMP3在鉴别诊断胸水RMs和MAC的灵敏度和特异度联合CK5/6+和IMP3-诊断胸水RMs时的灵敏度比单独运用CK5/6+更低(71.5%VS 78.1%),但是可以提高诊断的特异度(98.3%VS 85.5%)；联合IMP3+和CK5/6-诊断胸水MAC时的灵敏度比单独运用IMP3+更低(75.4%VS 88.2%),但可以提高诊断的特异度(98.2%VS 91.6%)。(3)运用普通PCR方法检测胸水MAC和RMs中CK5/6、IMP3和TTFl的DNA片段表达我们提取了9例ICC表达IMP3阴性的MAC标本和7例ICC表达CK5/6阴性的Ms胸水蜡块标本中的DNA,然后设计引物分别检测了这9例MAC标本中IMP3的DNA片段表达和7例RMs标本中CK5/6的DNA片段表达；结果发现前者有6例表达了487bp的IMP3 DNA片段(6/9),后者有4例表达394bp的CK5/6的DNA片段(4/7)。同时随机选取了6例LAC和6例NLAC胸水蜡块标本,对这12例标本均检测了IMP3和TTF1的DNA片段表达情况。结果发现6例LAC和6例NLAC标本中均检测到了487bp的IMP3的DNA片段表达(6/6,6/6)；而447bp的TTF1的DNA片段在LAC标本中均表达阳性(6/6),在NLAC标本中不表达(0/6),与免疫细胞化学结果一致。结论1.IMP3表达主要定位于肺腺癌细胞的细胞质,在癌旁组织不表达。2.IMP3表达与肺腺癌组织分化程度、临床分期和有无淋巴结转移等临床病理参数相关,而与年龄、性别和肿瘤大小无统计学意义。3.肺腺癌患者IMP3阳性组的五年生存期预后要比IMP3阴性组差,IMP3表达可以作为肺腺癌患者预后的独立影响因素。4.沉默IMP3基因可以抑制肺腺癌细胞的侵袭和增殖能力。5.联合运用IMP3、CK5/6和TTF1对胸水反应性间皮细胞、恶性间皮瘤、肺来源腺癌和其他组织来源腺癌具有重要的鉴别诊断意义。创新之处1.在组织和细胞水平探究了IMP3表达与肺腺癌侵袭性和患者预后的关系。2.提出联合IMP3、CK5/6和TTF1在胸水反应性间皮细胞、恶性间皮瘤、肺来源腺癌和其他组织来源腺癌的鉴别诊断思路,构建了一个树模型,具有一定的临床诊断参考价值。