论文部分内容阅读
α1抗胰蛋白酶（alpha1 antitrypsin，AAT）是一种重要的血浆蛋白，可维持体内蛋白酶-抗蛋白酶系统的平衡，具有细胞保护，免疫调节，控制炎症等多种生物学功能。正常人血浆中AAT的浓度为1.0～2.0 mg/ml，低于0.5 mg/ml时，则很难抑制弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）降解肺泡结缔组织中的弹力纤维，最终会引发肺气肿、慢性阻塞性肺疾病。 早在1987年，FDA就批准了第一个血浆来源的AAT冻干制剂（Prolastin）上市，用于治疗先天性AAT缺乏的肺气肿患者。近年来，多项研究表明AAT在控制自身免疫性疾病的发展及病原微生物感染中同样能够发挥积极的作用，因而具有广阔的临床应用前景。 AAT产品以低温乙醇法生产白蛋白的废弃物——Cohn Fraction IV（Cohn FIV）沉淀为起始原料进行制备，Cohn FIV沉淀保留了血浆中大约33％的AAT以及多种活性蛋白，弃去则会造成原料血浆的严重浪费。 为了提高血浆综合利用率，丰富我国血液制品品种，本研究作为国家863计划课题“血液制品规模化集成工艺研究及产品研发”的重要组成部分，以Cohn FIV沉淀为起始原料，开展AAT的分离纯化研究，最终建立了AAT纯化工艺，为规模化制备AAT奠定了基础。 本研究主要包括四个部分内容： 1．AAT纯化工艺的建立 根据AAT与Cohn FIV中其他蛋白在分子结构和理化性质上的差异，设计了4种纯化路线，以纯度为评价指标，优选合适的分离纯化方法，建立 AAT纯化工艺。 纯化工艺1主要利用AAT稳定空间结构、发挥生物学功能不需要二硫键来维持的特性，采用二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）还原杂蛋白的二硫键，使其变性。DEAE Sepharose Fast Flow（DSFF）弱阴离子交换层析吸附AAT，去除变性蛋白，Sephacryl S-200凝胶过滤层析筛分40～80kDa的小分子蛋白，最终获得的AAT纯度为55.53%。 纯化工艺2采用盐析法进行一步粗纯，通过研究不同饱和度硫酸铵以及分级硫酸铵沉淀法对提纯AAT的影响，最终确定以50%饱和度的硫酸铵沉淀大分子杂蛋白。上清中主要包括转铁蛋白、白蛋白、AAT，但由于三者的疏水性差别较小，采用疏水层析没有起到纯化效果。转铁蛋白可通过DSFF弱阴离子交换层析去除，最终获得的AAT纯度为43.61%。 纯化工艺3在层析精制中引入了蓝色琼脂糖亲和层析亲和白蛋白，白蛋白的存在将会大大降低AAT终产品的比活，层析条件为pH6.567mM磷酸盐缓冲液平衡介质，0.5 M KSCN洗脱柱上结合的蛋白。两步离子交换层析（Q Sepharose Fast Flow，DSFF）分别采用不同pH值的平衡条件以去除更多的杂蛋白。Q Sepharose Fast Flow（QSFF）为强阴离子交换层析介质，适用的pH值范围广，在加盐洗脱目的蛋白时，先进行一步低pH值（pH4.7）洗脱，可明显减少大分子杂蛋白。最终获得的AAT纯度为47.17%。 纯化工艺4以聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）4000沉淀法粗纯AAT， PEG4000的浓度及pH值均会影响除杂效果，研究表明pH5.2条件下，15%PEG4000可沉淀大分子杂蛋白及部分转铁蛋白，AAT损失少。在工艺3的基础上，调整层析顺序，先进行离子交换（QSFF），再亲和蛋白。最大的改进在于降低蓝色琼脂糖亲和层析平衡液的pH值至5.2，这不仅简化了工艺，还使得AAT终产品的纯度提高到98.17%，该纯度符合欧洲药典8.0版中AAT制剂的有关规定。高效液相色谱分析纯化样品仅出现一个响应值较高的色谱峰，说明其成分较为单一。综上所述，纯化工艺4更适合AAT的分离纯化。 2．AAT的鉴定 利用经典的蛋白质免疫印迹法及液质联用技术进行定性分析，精确测定蛋白的分子量。蛋白质免疫印迹法结果显示目标蛋白与羊抗人α1抗胰蛋白酶多抗发生特异性抗原抗体反应，呈现单一的显影条带。质谱检测到的肽段经Mascot检索得到74种蛋白，AAT排名第一，峰面积最大，分值最高，其他蛋白的数据与AAT相差1～2个数量级。上述结果表明本研究成功分离得到AAT。精确分子量测定结果显示AAT的分子量在50643.716～52375.84 Da范围内，主要以分子量51062.77 Da存在。 3．病毒灭活工艺的研究及验证 为保证制品的病毒安全性，本研究采用有机溶剂/去污剂法（solvent/detergent，S/D）灭活AAT制品中可能存在的囊膜病毒，干热法灭活囊膜病毒和非囊膜病毒。S/D法条件温和，对蛋白活性影响小，AAT的活性回收为95.62±2.63%。干热法的实验条件为100℃，30 min，通过比较不同保护剂作用下AAT的外观性状、复溶时间及活性回收情况，优选0.1 M组氨酸作为保护剂。对上述病毒灭活工艺进行验证，S/D法和干热法均能有效灭活指示病毒，分别可使相应指示病毒的病毒滴度下降4 Logs以上。 4．AAT冻干品的制备 为研究AAT纯化工艺放大的可行性，开展放大实验，制备AAT冻干品。具体流程为：Cohn FIV浓缩液→PEG沉淀→S/D法病毒灭活→QSFF→2步蓝色琼脂糖亲和层析→除菌分装→冻干→干热灭活。AAT终产品的纯度为95.54%，纯化倍数约66.34倍，比活为3935.57U/mg，活性回收率为22.55%。从1LCohn FIV浓缩液中可获得120瓶AAT冻干品（10 mg/瓶）。 本研究成功建立了 AAT实验室纯化工艺，初步放大所得终产品的纯度＞95%，符合欧洲药典8.0版中AAT制剂的纯度要求。该工艺的建立为规模化制备AAT奠定了基础。