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目的: 研究天冬多糖对人肝癌细胞生长及侵袭迁移能力的影响,初步探讨天冬多糖抑制肝癌细胞血管新生的作用机制,以期从分子水平了解低氧对肝癌血管新生的影响及天冬多糖抗肝癌血管新生的机理,为临床上肝癌的靶向治疗提供实验依据。 方法: 1.构建HIF-1α慢病毒过表达载体并将该病毒载体感染人肝癌HepG2细胞,形成稳定过表达HIF-1α的HepG2细胞,GFP荧光表达评定慢病毒感染情况;Real-timePCR检测HIF-1α的表达。 2.构建靶向HIF-1α的RNA干扰质粒,通过Real-time PCR筛选最佳感染效果的质粒。 3.CCK-8法测定天冬多糖对常氧及低氧培养下HepG2细胞24、48和72h的抑制率。 4.Transwell实验观察天冬多糖对HepG2细胞侵袭和迁移的影响。 5.用Real-time PCR、Western blot法检测天冬多糖对低氧诱导的HepG2细胞HIF-1α、VEGF、EGF、ANGPT mRNA、蛋白水平的影响。 6.用Western blot法检测天冬多糖对HIF-1α过表达和低氧下干扰HIF-1α的HepG2细胞HIF-1α、VEGF、EGF、ANGPT蛋白水平的表达影响。 结果: 1.在HepG2细胞中,与阴性对照(空载体病毒)组和空白对照组(未感染)相比,感染HIF-1α过表达(HIF-1α+/+)组的GFP荧光染色表达较强,HepG2细胞HIF-1α的mRNA表达明显上调(P<0.05),提示HIF-1α过表达慢病毒已感染人肝癌HepG2细胞。 2.在HepG2细胞中,转染HIF-1αsiRNA-934/1036/834/764四个位点的干扰质粒组与阴性对照组(Control siRNA)相比,HIF-1αmRNA表达水平均下调(P<0.05)。共同转染HIF-1αsiRNA-934/1036/834/764组与空白对照组(HepG2)相比,HIF-1αmRNA表达水平均下调(P<0.05)。其中HIF-1αsiRNA-934质粒干扰效果最好。结果证实靶向HIF-1α的siRNA下调HepG2细胞HIF-1α的mRNA表达。 3.天冬多糖对低氧下培养的HepG2人肝癌细胞有明显的增殖抑制作用,相关性分析示,细胞生长抑制率与天冬多糖浓度呈正相关(r=0.980,P<0.05),具有剂量依赖性。其48h的IC50、IC20、IC10分别为2480μg/mL、992μg/mL和496μg/mL,常氧下的IC50、 IC20、 IC10分别为3170μg/mL、1268μg/mL和634μg/mL。 4.天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组的侵袭及迁移细胞数均低于空白对照组(P均<0.01)。 5.天冬多糖低、高浓度干预HepG2细胞48h后,细胞中HIF-1α、VEGF、EGF、ANGPT的mRNA和蛋白水平均显著低于空白对照组,且具有药物剂量依赖性(P均<0.05)。 6.常氧下过表达的HIF-1α能明显上调HepG2细胞VEGF、EGF、ANGPT的蛋白表达,低氧下靶向HIF-1α干扰显著下调了HepG2细胞VEGF、EGF、ANGPT的蛋白表达。低浓度天冬多糖分别作用于HIF-1α干扰组和HIF-1α过表达组后,显著下调HepG2细胞VEGF、EGF、ANGPT的蛋白表达(P<0.05)。其中HIF-1αsiRNA-934+天冬多糖组的抑制效果最为显著。 结论: 1.成功构建HIF-1α慢病毒过表达载体,建立稳定过表达HIF-1α的肝癌细胞株,HIF-1α慢病毒过表达能明显上调人肝癌HepG2细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达。 2.天冬多糖对人肝癌HepG2细胞在体外常氧和低氧两种培养条件下均有不同程度的生长抑制作用,存在着量效关系。低氧状态下,天冬多糖对肝癌细胞增殖抑制更显著,并能有效抑制人肝癌细胞的侵袭与迁移。 3.天冬多糖通过下调常氧下HIF-1α过表达和低氧下干扰HIF-1α两种条件下HIF-1α的表达,抑制低氧下促血管生长因子VEGF、EGF、ANGPT的表达,这可能是天冬多糖体外发挥抗血管生成的部分机制。