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目的:
Rho家族蛋白是小G蛋白家族中的成员之一,其具有GTP酶活性,Rho家族蛋白在基因转录、细胞周期调控、膜泡运输中起重要作用,Rho亚家族包括有RhoA,B,C,D和E等蛋白。研究发现,RhoA在人类多种恶性肿瘤中异常表达,并在其发生发展和侵袭转移中发挥重要作用,它可以调节多种转录因子的活性,其中大多数因子参与肿瘤的形态学发展。有研究证明在乳癌,肺癌,消化道肿瘤,头和颈部鳞状细胞癌组织,上皮性卵巢癌及伴有转移的淋巴组织中RhoA高表达,在肿瘤组织中RhoA的高表达与肿瘤分化程度、淋巴转移和短生存期相关。RhoC基因与恶性肿瘤的侵袭和转移有关。最近的研究显示,RhoC在乳腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤中高表达并与肿瘤的进展之间存在相关性。从目前研究来看,RhoA,RhoC在众多肿瘤的发生中起着重要作用,虽然已经有大量的研究证明RhoA,RhoC在肿瘤的发生中的作用,但目前国内外关于RhoA,RhoC与外阴肿瘤的具体关系尚少有报道,外阴硬化性苔藓是一种慢性皮肤病,长时间随访的流行病学研究发现其有恶变的倾向约5%。Rho家族蛋白在其发生发展中有何作用,尚不清楚。因此,本研究将检测外阴正常组织,外阴硬化性苔藓及外阴鳞痛组织中RhoA和RhoC蛋白的表达情况,探讨其与外阴疾病的关系。
材料及方法:
一、实验材料
1、标本
选自中国医科大学附属第一医院病理教研室1998~2009年经手术切除及活检存档的蜡块:外阴鳞癌(VSCC)30例,外阴硬化性苔藓(VLS)15例;外阴正常皮肤10例。所有患者病理资料完整,标本均经病理学证实,均末行放化疗及激光等物理治疗。收集外阴鳞癌患者的临床病理资料进行统计分析,包括:临床分期、病理分级。
2、试剂
兔抗人RhoA多克隆抗体(工作浓度1:100),兔抗人RhoC多克隆抗体(工作浓度1:100),即用型SABC试剂盒,DAB显色液均购自北京博奥深生物工程有限公司。
二、实验方法
采用SABC免疫组织化学方法分别检测RhoA和Rhoc在外阴正常皮肤,外阴硬化性苔藓,外阴鳞癌中的表达。
三、免疫组化染色结果判定标准
在光学显微镜下观察以细胞浆或细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性,利用显微图像分析系统Meta Morph(UIC/OLUMPUS.US/JP)进行积分光密度测定,每张切片选取5个不同视野,计算同一张切片的平均积分光密度值。
四、统计学处理
利用SPSS13.0统计分析软件,各组计量资料的结果进行t检验,P<0.05有统计学意义。
实验结果:
1、RhoA蛋白在外阴不同组织中的表达情况
RhoA蛋白表达于细胞浆,呈棕黄色颗粒。RhoA在外阴正常皮肤阳性细胞多位于基底细胞层(图1),阳性细胞的平均光密度值30.18±1.46,在LS中阳性细胞位于表皮中下层,部分近全层(图2)。LS中表达阳性细胞的平均光密度值47.05±1.23,两者有显着性差异(p<0.05)在VSCC中癌巢中阳性细胞呈弱表达,间质中有较多的阳性细胞(图3)。RhoA蛋白表达阳性细胞的平均光密度值89.32±2.08,与正常相比有统计学上的差异(P<0.05)。
2、RhoA蛋白与外阴鳞癌临床病理的特征的关系
RhoA在不同病理分级中表达为:高分化78.18±2.89,中分化92.15±1.12,低分化105.05±2.80。高、中分化与低分化相比差异显著(P<0.05)。在Ⅰ-Ⅱ期外阴鳞癌中表达为82.83±3.35,Ⅲ-Ⅳ期为97.05±1.23,两者相比有统计学上的差异(P<0.05)。
3、RhoC蛋白在外阴不同组织中的表达情况
RhoC蛋白表达于细胞浆,呈棕黄色颗粒。RhoC在外阴正常皮肤可见少量的阳性细胞位于基底细胞层(图4),阳性细胞的平均光密度值5.42±1.23,在LS中阳性细胞位于基底层以上达全层表皮细胞内,基底层近阴性。(图5)。LS中表达阳性细胞的平均光密度值36.07±2.75,两者有显着性差异(p<0.05)。在VSCC中阳性细胞主要分布在癌巢中(图6),RhoC蛋白表达阳性细胞的平均光密度值83.51±2.84,与正常相比有统计学上的差异(P<0.05)。
4、RhoC蛋白与外阴鳞癌临床病理的特征的关系
RhoC在不同病理分级中表达为:高分化72.06±2.13,中分化80.49±3.16,低分化88.12±2.62。高、中分化与低分化相比差异显著(P<0.05)。在Ⅰ-Ⅱ期外阴鳞癌中表达为74.13±2.73,Ⅲ-Ⅳ期为89.69±1.23,两者相比有统计学上的差异(P<0.05)。
结论:
1、RhoA、RhoC蛋白表达增加与外阴癌的发生有关,与外阴癌的分化程度和恶性进展呈正相关。
2、RhoA蛋白与正常外阴皮肤基底细胞的构建、迁移有关。可能参与黑素细胞树突形成和延伸。
3、RhoA、RhoC蛋白可能先后参与硬化性苔藓表皮下部和上部细胞的迁移运动。