研究背景子宫内膜异位症(endometriosis, EM)是育龄期妇女中十分常见的妇科疾病,发病率大约在10%-15%,因其能够引起严重的临床症状,如下腹痛、痛经、性交痛、不孕等,对广大妇女的心身健康造成极大的影响。当今随着大众健康意识的提高,发病率有逐年上升的趋势。自从19世纪该病报导以来,虽然经过对该病一个多世纪的研究,其发病机制仍不清楚。纵观各大学说,如子宫内膜种植学说、体腔上皮化生学说、淋巴和静脉播散学说及近期报道的干细胞学说、血管形成学说、在位内膜决定论学说、内分泌及免疫学说等,均只能部分揭示该疾病的发生发展过程,仍无法系统的揭示其全面的发病机制,所以对子宫内膜异位症的治疗目前仍无较好的方案。然而,无论何种学说,异位子宫内膜的生长必须经过黏附、侵袭及血管生成这3个环节,因此,如能阻断其中的某一过程,就能抑制子宫内膜异位症的发生发展。子宫内膜异位症虽然为良性疾病,但其具有类似肿瘤的特性,如子宫内膜异病灶可在盆腹腔内发生转移,形成相应的病变。目前,针对子宫内膜异位症的治疗主要集中在激素类药物及手术治疗,但治疗效果均不理想,复发率较高,因此,寻找新的治疗方法显得尤为重要,目前,基因治疗已逐渐成为一种新的治疗策略。研究显示,核因子κB (NF-κB)作为一种核转录因子,最早发现于B淋巴细胞内,因其可与免疫球蛋白轻链基因增强子K B结合而被命名为NF-κ B,其家族中有五个成员(RelA(p65)、RelB、c. Rel、NF-κB1(p50和它的前体p105)和NF-κB2(p52和它的前体p100)),该因子广泛存在于各种组织细胞中,正常情况下该因子以同源或者异源二聚体的形式与抑制蛋白IκB结合而存在于胞浆中,受激活因子刺激激活后,与I KB分离进入细胞核内调控目的基因的合成。目前发现,该因子在调控细胞增殖、血管形成、炎性反应、细胞凋亡等生理病理过程中起着非常重要的作用。有文献报道,该因子与乳腺癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌、宫颈癌等疾病的发生、发展及预后过程均存在一定的相关性；同时,也有文献报导NF-κB也参与子宫内膜异位症的病理生理过程。本课题组通过前期在裸鼠体内的试验也证实,NF-κB在裸鼠子宫内膜异位症的发生发展中起着重要作用,抑制NF-κB基因表达后,异位病灶明显萎缩,微血管密度明显减小。但裸鼠毕竟是低等动物,很多生理功能与人类差距很大,因此,本研究采用与人类最接近的大型灵长类动物作为实验对象,通过RNA干扰技术,短发夹状RNA (shRNA)靶向抑制NF-κB基因的表达,观察其对灵长类动物子宫内膜异位症异位病灶发生发展的影响,初步评估其对食蟹猴子宫内膜异位症的体内治疗效果及其安全性。目的1.通过体外手术方法构建食蟹猴子宫内膜异位症模型,并观察该建模手术的效果,为构建大型灵长类动物子宫内膜异位症模型增加更多的选择。2.体外培养食蟹猴在位子宫内膜细胞,同时合成高特异性靶向NF-κB基因的shRNA腺病毒载体,利用该病毒载体干预原代培养的食蟹猴子宫内膜细胞,通过比较实验组及对照组之间的凋亡细胞数目及凋亡蛋白的表达情况,评估其对体外培养的食蟹猴子宫内膜细胞的增殖活动是否具有直接的抑制效应。3.成功构建食蟹猴子宫内膜异位症模型后,利用前期合成的NF-κB-shRNA腺病毒载体,对内异病灶进行直接注射,通过靶向抑制子宫内膜异位症NF-κ B基因的表达后,观察在干预后各组内异位病灶在微血管密度、细胞核增殖抗原(PCNA)及NF-κB表达等的改变,评估其在治疗食蟹猴子宫内膜异位症发生发展中的作用,并观察其远期毒副作用。方法1.选择15只健康、体重相近、月经周期规律的雌性食蟹猴,分成实验组及对照组,实验组12只,对照组3只,术前进行六个月经周期的观察,排除不健康食蟹猴。2.在月经周期的第8-15天,雌激素高峰的第3-5天,实验组行手术获取子宫内膜组织,分别种植到自体盆腔大网膜、子宫直肠窝、子宫表面等处；对照组以大网膜组织代替子宫内膜组织种植到相同的位置。3.分别于手术后第8周及第16周月经周期的第8-15天行腹腔镜探查,取可疑病灶行组织病理学检查,观察内异病灶镜下有无子宫内膜样腺体结构及间质细胞。4.设计携带有NF-κ B-p65基因的shRNA腺病毒载体及相应空载shRNA腺病毒载体,并进行体外合成。5.手术获取新鲜食蟹猴子宫内膜组织,体外进行食蟹猴子宫内膜细胞原代培养,分成实验组及对照组。实验组转染携带NF-κ B-p65 shRNA的腺病毒,对照组转染携带空载shRNA腺病毒载体,然后进行共培养。比较两组之间凋亡蛋白的表达及细胞周期的变化情况。6.准备好构建成功的食蟹猴子宫内膜异位症动物模型及高特异性的靶向NF-κ B基因的shRNA腺病毒及其阴性对照空载shRNA腺病毒。7.将建模成功的食蟹猴分成实验组、阴性对照组及单纯建模组,将NF-κB shRNA腺病毒在腹腔镜下直接注入实验组食蟹猴子宫内膜异位病灶内,阴性对照组在病灶内注射空载shRNA腺病毒,单纯建模组病灶内注射生理盐水。8.注射腺病毒后4周,腹腔镜下观察病灶变化,取各组子宫内膜异位病灶进行CD34免疫组化染色检测微血管密度,并采用蛋白印迹法(western blot)检测NF-κB及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,6个月后处死各组食蟹猴,观察各重要脏器的远期副作用。9.统计学分析：本实验所有数据计量资料均采用均数±标准差(x±SD)描述,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用两独立样本t检验,检验水准均为α=0.05。结果1.术前对食蟹猴精神状态、食欲、睡眠情况和月经周期的观察：通过近六个月经周期的观察,发现所有食蟹猴精神均良好,无嗜睡、困怠的现象,观察期间,食蟹猴睡眠、食欲均良好。所有食蟹猴均有规律的月经周期,时间大概28-30天左右,行经4-5天,与正常妇女月经周期类似。2.术后第8周探查显示,15只实验猴中,5只盆腔内膜种植处肉眼可见疑似异位内膜病灶改变,5只形成异位囊肿,另外2只种植处肉眼未见异位病灶存在,可疑病灶行组织病理检查可见完整腺体和间质细胞结构。3只对照组食蟹猴未见可疑病灶,取组织活检未见整腺体和间质细胞结构。术后第16周,再次行腹腔镜探查,肉眼仍可见子宫内膜异位病灶,并且存在不同程度的盆腔粘连,异位内膜生长情况与术后第8周基本相似。3.成功合成了高特异性的腺病毒载体,对腺病毒载体进行PCR和测序结果与预期结果一致, 经包装产生的病毒滴度为1.58×1011U/m1。4. NF-κ B-p65 shRNA腺病毒感染食蟹猴子宫内膜细胞后,实验组子宫内膜细胞凋亡蛋白的表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)；实验组进入细胞分裂期细胞数明显少于对照组。5.实验组食蟹猴异位病灶较前萎缩,其微血管密度(0.00198±0.0003)较阴性对照组(0.02189±0.0026)、单纯建模组(0.02451±0.0033)明显减小,分别比较,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组食蟹猴NF-κB蛋白的表达水平(0.338±0.174)较阴性对照组(0.678±0.021)、单纯建模组(0.645±0.098)明显下降,分别比较,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组食蟹猴PCNA蛋白的表达水平(0.37±0.17)低于阴性对照组(0.57±0.26)、单纯建模组(0.57±0.28),分别比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.此次研究根据种植学说原理在国内首次成功构建了食蟹猴子宫内膜异位症动物模型,为以后子宫内膜异位症在食蟹猴的研究提供了理论基础,为子宫内膜异位症在非人灵长类动物模型的研究领域增加了新的动物选择,并不是所有食蟹猴能成功构建子宫内膜异位症模型提示个体遗传、免疫等其他因素亦可能影响子宫内膜异位症的发生。2.携带NF-κB基因的腺病毒体外感染食蟹猴子宫内膜细胞后可加速子宫内膜细胞的凋亡,并抑制子宫内膜细胞的增殖,为后期该基因在食蟹猴子宫内膜异位症模型上的研究提供理论基础。3. NF-κB shRNA通过靶向抑制NF-κB基因的表达后,能够抑制食蟹猴子宫内膜异位症的进展,抑制子宫内膜异位病灶的血管生成能力,减弱异位子宫内膜细胞的增殖能力。