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大肠杆菌型脑膜炎是一种急性致死性疾病,存活者通常患有神经损伤后遗症,严重威胁着人类和动物的健康。至今仍使用抗生素治疗大肠杆菌型脑膜炎,尚无有效的疫苗防治。目前新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal Meningitis Escherichia coli,NMEC)是主要引起人类新生儿脑膜炎的病原菌,但是近年来,研究者们报道禽致病性大肠杆菌(Avain Pathogenic Escherichia coli,APEC)APEC TW-XM 菌株引起禽类的脑膜炎,并且与NMEC基因组相似、相同的易感动物模型。因此,很有必要预警禽致脑膜炎型大肠杆菌引起潜在的人兽共患病,而APEC TW-XM的致病机制有待深入探索。外膜蛋白A(Outer membrane protein A,OmpA)是大肠杆菌外膜的重要蛋白,能够维持细菌结构稳定,促进细菌的黏附和侵袭,影响细菌的致病性。OmpA的研究多数集中在NMEC中,在NMEC穿过血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)过程中扮演重要的角色,而在禽致脑膜炎型大肠杆菌中的作用鲜有研究报道。本研究以OmpA为切入点,探究其在APEC TW-XM病原菌突破BBB感染宿主过程中的致病机制。通过比对NCBI GenBank上相关致脑膜炎型大肠杆菌菌株的ompA基因序列,设计相应保守的PCR引物,成功扩增APEC TW-XM菌株中ompA基因。随后,利用λ-Red同源重组构建APEC TW-XM菌株中编码基因ompA缺失株。通过基因克隆技术,将ompA基因克隆至表达质粒载体pBR322并转化至APEC TW-XM△ompA缺失株中,成功构建回补株APECTW-XMΔo mpA/pompA。细菌生长曲线实验结果显示OmpA的缺失并不影响细菌的正常生长能力。通过利用BBB体外模型小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain microvascular endothelial cells,bEnd.3 cells)来探究 OmpA 对于 APEC TW-XM穿过BBB导致脑膜炎发生的影响,APEC TW-XM黏附侵袭bEnd.3细胞试验结果显示,与野生株和回补株相比,缺失株对bEnd.3细胞的黏附和侵袭能力分别显著下降约37%和43%(p<0.01)。用qRT-PCR检测bEnd.3细胞内炎症因子表达的实验结果表明,与野生株感染组相比,ompA基因缺失株感染组bEnd.3细胞内IL-6、IL-1β、iNOS炎症因子的表达在转录水平显著下降,分别下降75%、76%、70%(p<0.01),回补株感染组中炎症因子的表达与野生组无统计学差异(p>0.05)。同时利用qRT-PCR和Western blot检测bEnd.3细胞上紧密连接蛋白的表达,与野生株感染组相比较,缺失株感染组bEnd.3细胞上ZO-1、Occludin、Claudins-5紧密连接蛋白的表达在转录(分别为54%、50%、65%,p<0.01)和蛋白(36%、40%、64%,p<0.01)水平上均显著升高,而回补组与野生组相比无统计学差异(p>0.05),表明OmpA的缺失降低了 APEC TW-XM的致病能力,影响细菌破坏BBB引起脑膜炎的能力。为深入探究OmpA蛋白如何促进APECTW-XM黏附侵袭细胞,影响促炎因子和细胞间紧密连接蛋白表达的机制,我们利用qRT-PCR和Western blot试验检测其在细胞表面的受体蛋白gp96的表达,结果显示,与野生株感染组比较,缺失株感染组bEnd.3细胞上gp96的表达在转录(下降67%,p<0.05)和蛋白(下降50%,p<0.01)水平均显著下降,回补组与野生组相比无统计学差异(p>0.05)。以上体外实验结果表明,OmpA可以通过影响受体gp96的表达,促进APEC TW-XM黏附侵袭bEnd.3细胞,并且调节细胞内促炎因子以及紧密连接蛋白的表达,从而影响细菌对BBB的侵袭。为了进一步探究OmpA在APEC TW-XM突破BBB中的体内致病机制,我们对小鼠进行腹腔接种APEC TW-XM菌株,通过对脑膜炎临床神经症状的观察和评分成功构建了 APECTW-XM致小鼠脑膜炎的模型。小鼠的存活实验表明,缺失株感染组存活时间(平均20小时)比野生株感染组(平均11.4小时)显著延长。同时,野生株、缺失株、回补株感染组的死亡率分别为100%(10/10)、40%(4/10)、90%(9/10)。利用伊文思蓝(Evans Blue,EB)测定检测小鼠BBB通透性结果表明,野生株和回补株感染组小鼠脑部明显呈蓝色。EB定量试验结果表明,缺失株感染组的小鼠脑部EB含量相比野生株感染组显著降低37%(p<0.01)。表明APEC TW-XMΔompA缺失株感染的小鼠BBB通透性降低。脑组织的细菌计数结果进一步表明,与野生株感染组相比,缺失株突破BBB定殖小鼠脑内的能力显著下降67%(p<0.01)。之后用qRT-PCR检测小鼠脑组织中炎症因子表达情况的结果表明,与野生株感染组相比,缺失株感染组小鼠脑组织内IL-6、IL-1β、iNOS炎症因子的表达在转录水平均显著下降,分别下降67%、49%、64%(p<0.01),回补株感染组结果与野生组无统计学差异(p>0.05)。利用qRT-PCR和Western blot检测小鼠脑内紧密连接蛋白表达的结果显示,与野生株感染组相比较,缺失株感染组小鼠脑脑组织上ZO-1、Occludin、Claudins-5紧密连接蛋白的表达在转录(分别升高 42%、36%、41%,p<0.01)和蛋白(分别升高 34%、61%、31%,p<0.01)水平均显著升高。回补组表达情况与野生组无统计学差异(p>0.05)。最后,我们利用qRT-PCR和Western blot检测小鼠脑内OmpA蛋白受体gp96的表达,与野生株感染组比较,缺失株感染组的小鼠脑组织上gp96的表达在转录(下降68%,p<0.05)和蛋白(60%,p<0.05)水平均显著下降,回补组gp96的表达与野生组无统计学差异(p>0.05)。上述结果与体外实验结果相一致,均证明OmpA影响APECTW-XM突破BBB引起脑膜炎的致病能力。体外和体内实验结果表明,OmpA可以通过影响受体gp96的表达,促进APEC TW-XM黏附侵袭BBB以及在脑部的定殖,并且调节BBB促炎因子以及紧密连接蛋白的表达,从而影响细菌对BBB的损坏和侵入中枢神经后导致的严重炎症反应。