【摘 要】
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目的:探讨IRX5对结肠癌基因组不稳定性造成的影响,并探讨基因组不稳定性产生的原因和基因组不稳定性是否对细胞增殖,细胞周期,细胞衰老产生影响。方法:通过转染的方法将IRX5过表达病毒液转染置人结直肠癌细胞系SW480和DLD-1,用嘌呤霉素筛选稳定表达IRX5的细胞系,用QRT-PCR和Western blot鉴定是否成功构建了IRX5过表达细胞系。然后采用CCK-8检测IRX5对细胞增殖的影响;
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目的:探讨IRX5对结肠癌基因组不稳定性造成的影响,并探讨基因组不稳定性产生的原因和基因组不稳定性是否对细胞增殖,细胞周期,细胞衰老产生影响。方法:通过转染的方法将IRX5过表达病毒液转染置人结直肠癌细胞系SW480和DLD-1,用嘌呤霉素筛选稳定表达IRX5的细胞系,用QRT-PCR和Western blot鉴定是否成功构建了IRX5过表达细胞系。然后采用CCK-8检测IRX5对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测IRX5对细胞周期的影响,Western blot检测IRX5对细胞周期蛋白cyclin A2,cyclin B1,cyclin D1,cyclin E1,P21,P53的调节。细胞免疫荧光和Western blot检测IRX5对DNA损伤标志物RH2A水平的影响;细胞衰老实验检测IRX5对细胞衰老的调控。细胞免疫荧光检测IRX5对ATM水平的影响;后采用si RNA-ATM转染SW480-IRX5,DLD-1-IRX5细胞株,QRT-PCR检测ATM的敲降效率后用CCK-8检测ATM对细胞增殖的影响;用Western blot和细胞免疫荧光检测ATM对RH2A水平的影响;用细胞衰老实验检测ATM对细胞衰老的调控。最后用CCK-8检测IRX5对细胞对5-fu耐药性的影响,用无血清生长实验检测IRX5对细胞无血清抗性的影响。结果:QRT-PCR和Western blot结果显示成功构建稳定表达IRX5的SW480-IRX5和DLD-1-IRX5细胞模型。CCK-8结果显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5在培养96h后的细胞数量显著少于相应对照组;流式细胞仪检测细胞周期结果显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5在G1期所占比例高于相应对照组。Western blot显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5中cyclin A2,cyclin B1和cyclin D1水平低于相应对照组,cyclin E1,P21和P53水平高于相应对照组。细胞免疫荧光和Western blot显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5中DNA损伤标志物——RH2A水平高于相应对照组;细胞衰老实验显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5中具有细胞衰老标志物——SA-β-gal阳性特征的细胞数多于相应对照组。细胞免疫荧光实验显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5中ATM的荧光染色强度高于相应对照组;QRT-PCR显示si RNA-ATM1和si RNA-ATM4分别在SW480-IRX5和DLD-1-IRX5中敲降效率最高;CCK8结果示SW480-IRX5 ATMi和DLD-1-IRX5ATMi在培养96h后的细胞数量显著高于相应对照组;细胞免疫荧光和Western blot显示SW480-IRX5 ATMi和DLD-1-IRX5 ATMi中RH2A水平低于相应对照组;细胞衰老实验显示SW480-IRX5 ATMi和DLD-1-IRX5 ATMi中具有SA-β-gal阳性特征的细胞数少于相应对照组。CCK8显示在相同浓度5-fu处理下SW480-IRX5和DLD-1-IRX5存活的细胞数量多于相应的对照组;无血清生长实验显示SW480-IRX5和DLD-1-IRX5存活的细胞数量多于相应的对照组并且细胞形状比相应的对照组更扁平。结论:IRX5激发了由ATM介导的结直肠癌细胞的基因组不稳定性,从而引起G1/S期的细胞周期阻滞进一步导致了细胞增殖的抑制和衰老的发生。
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