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禽白血病病毒(avian leukosis viruses,ALV)是一种反转录病毒,在鸡群中普遍存在,可造成1%~2%的成年鸡诱发内脏肿瘤并导致死亡。能感染鸡的可分为A、B、C、D、E和J等6个亚型,临床上常见J和A亚型,E亚型本身无致病性。过去十几年,ALV病毒对肉用型鸡、蛋用型鸡和我国地方品系鸡的感染给养殖业造成了巨大经济损失。近几年,鸡白血病/血管瘤病例的显著上升使该病成为危害我国蛋鸡业的主要疫病之一,并在临床上发现纤维肉瘤的典型病例。本研究分别从临床商品代海兰褐蛋鸡和实验室致病性试验SPF鸡中,获得两例表现典型纤维肉瘤的病例,分别进行了病毒分离鉴定及人工致病性试验研究。1海兰褐蛋鸡急性纤维肉瘤的鉴别诊断及人工致病试验2010年6月,山东新泰某商品代海兰褐蛋鸡场,存栏8000只,90d开始发病,至240d死亡率在25%左右。其中有一只病鸡(29号),在心脏后端,胸骨下缘有一肉瘤团。本试验在此基础上,采集此肿瘤病料,进行病毒分离、鉴定并进行人工致病试验。1.1肿瘤组织的病毒分离及鉴定获取的肿瘤病料研磨滤过液接种DF-1细胞,培养5-7 d后传代,加到有盖玻片的平皿中,再继续培养5-7 d,取细胞培养上清用禽白血病病毒p27抗原检测试剂盒检测ALV p27抗原,盖玻片上抗原阳性上清的细胞固定,分别用JE9、11B154、H19及用抗ALV-A/B gp85的小鼠血清对盖玻片上的单层细胞分别做IFA,表明肿瘤病料存在ALV-J的明显的感染,可能存在ALV-A/B亚群的感染,但是不存在MDV和REV的感染。1.2肿瘤组织的病理组织学观察肿瘤组织病理组织学显示均为纤维细胞样肉瘤,纤维排列凌乱,细胞大小不一。1.3肿瘤组织分离株的序列分析ALV分离株的前病毒基因组DNA中扩增2.2kb包括部分LTR区和完整env基因的片段,PCR扩增产物经克隆、测序后,利用DNAStar软件对基因产物进行序列分析。gp85基因编码的氨基酸序列与其它参考株的比较ALV分离株的gp85基因编码的氨基酸序列与11株ALV-J亚群参考株的同源性均在87.5%以上,而与ALV-A、B、C、D、E亚群参考株的同源性仅在37.6%-40.1%之间,进化树分析也显示分离株与ALV-J亚群参考株的同源关系最近。这表明分离株属于ALV-J亚群病毒。gp37基因编码的氨基酸序列与其它参考株的比较此毒株的gp37编码的氨基酸序列与J亚型参考株的同源性在92.7%~94.9%范围内,同源性较高。与其他亚群的同源性在59.0%-60.8%之间。1.4海兰褐鸡肿瘤组织的人工致病试验肿瘤组织团块,加入3倍体积的PBS研磨,直至成匀浆液并用滤器过滤,得病料原液。不同日龄海兰褐鸡的人工造病试验病料原液,按颈部皮下和腹腔注射两种方法分别接种1d,7d,14d,180d,240d的海兰褐蛋鸡,结果显示不同日龄的鸡在2种注射方式均能复制出肿瘤,仅是肿瘤出现的时间不同;1d、14d能在10d左右出现,180d后在20d左右出现;但肿瘤的发生率和致死率均为100%。颈部皮下注射组除了引起颈部皮下肿瘤,还会引起胸腺和脾脏的萎缩,甚至是肝脏或者脾脏的肉瘤或血管瘤;腹腔注射组除了在肌胃和肠系膜上看到明显的肿瘤结节外,有的还可以引起肝脏和脾脏的肉瘤和血管瘤,但不能引起颈部皮下的肿瘤。1日龄海兰褐鸡颈部皮下注射组的肿瘤生长情况1d海兰褐鸡肿瘤的生长,在攻毒开始后一个星期内没有任何变化,生长至9d,大部分鸡可以在颈部皮下用手触摸到米粒大小的团块,随后几天肿瘤生长迅速,5d-6d后直径可达到30多毫米。1.5人工造病肿瘤组织的病毒分离鉴定及形态学观察人工致病性试验生长出的肿瘤,按原始肿瘤组织的处理方法进行病毒的分离鉴定及肿瘤组织的形态学观察。结果表明,人工致病性试验获得肿瘤存在ALV-J的明显的感染,可能存在ALV-A/B亚群的感染,但是不存在MDV和REV的感染。肿瘤病料、触片,吉姆萨染色和病理组织学观察看出,肿瘤细胞个体不均一,形状多样,细胞核较大、浓染,有的可以发现明显的核分裂相;为典型的纤维细胞样肉瘤。2一例A亚型禽白血病病毒引起SPF鸡纤维瘤的病理学和病毒学分析SDAU09C3是分离于海兰褐蛋鸡的ALV-A亚群毒株,人工卵黄囊接种5dSPF鸡胚3000TCID50,生长至7个月人工剖杀获得肾脏和肝脏表现明显局灶性大结节的典型病例。2.1 SPF鸡纤维肉瘤的病毒分离及鉴定及序列分析IFA检测结果表明,肾脏和肝脏肿瘤存在ALV-A/B的感染,但不存在ALV-J、MDV、REV感染。肝脏和肾脏分离株与原攻毒株囊膜蛋白gp85基因编码的氨基酸序列同源性为99.5%。2.2 SPF鸡纤维肉瘤的病理组织学观察SDAU09C3毒株引起的肿瘤,主要胶原纤维较少,细胞及纤维排列极不规则,为纤维细胞肉瘤。2.3 SPF鸡纤维肉瘤的人工致病性试验肝脏和肾脏的肿瘤研磨滤过液,攻1日龄SPF鸡后,连续观察至75日龄,肝脏、肾脏肿瘤浸出液中未能检出在生物学上能显示急性致肿瘤性的病毒。