研究目的及意义过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR),又称变应性鼻炎,是一种常见的过敏性疾病。其发病与多种因素相关,如遗传因素、环境因素以及变应原的暴露,随着现在环境因素的改变,过敏性鼻炎的发病率也越来越高。目前国际上治疗过敏性鼻炎的方法主要有以下三种：远离过敏源、药物疗法和免疫疗法。过敏性鼻炎患者除了尽量远离过敏源外,采用的最多的仍然是药物疗法。药物疗法主要包括西药治疗与中医药治疗两种,西药治疗见效快,疗效确切,但这些药物一般只能控制AR症状,不能达到根治目的,且不良反应多,如鼻用皮质类固醇可造成鼻腔干燥、鼻出血和鼻中隔穿孔等局部副反应,更有甚者会引起全身的副反应如对下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制,抑制儿童生长,引发白内障及青光眼等眼部并发症等；抗组胺药物的副作用更为明显,如可引起患者困倦、头痛、眩晕、判断力和操作能力下降以及引起心血系统的副作用。中医药疗法相对于西药治疗的副作用小、疗效也更持久,因此得到多数人的青睐,近几年有许多研究者开始对中药复方治疗该病进行了研究。麻黄附子细辛汤为张仲景《伤寒论》中的经典名方,由麻黄、附子、细辛三味药组成。数年来,经临床证明,麻黄附子细辛汤在治疗过敏性鼻炎方面,治疗效果非常显著。因此,课题组前期对麻黄附子细辛汤抗过敏性鼻炎的作用进行了比较系统的研究,发现麻黄附子细辛汤在改善过敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜炎症反应,减轻鼻痒、流鼻涕、打喷嚏等症状,降低血液组胺含量方面效果优于中成药辛芩颗粒；附子总碱及细辛挥发油有明显降低过敏性鼻炎模型豚鼠血液中组胺的含量,改善鼻黏膜炎症的局部浸润;除此之外,发现麻黄附子细辛汤含药血清可以抑制抗原诱导的RBL-2H3肥大细胞释放组胺、β-氨基己糖苷酶,抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导小鼠脾细胞增殖,并将这些药效指标通过与含药血清中化学成分的相对含量进行相关性分析,从而在理论上推导出麻黄附子细辛汤抗过敏性鼻炎的药效物质(包括甲基伪麻黄碱、伪麻黄碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头原碱及几个未知成分)。本研究拟对麻黄附子细辛汤组方药材的活性部位(麻黄总碱提取物,附子总碱提取物,细辛挥发油及其水煎液)及部分成分(盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、盐酸去甲基麻黄碱、盐酸去甲基伪麻黄碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱)进行抗过敏性鼻炎的成分验证及相关机制的研究。根据前期的研究,以参与过敏性鼻炎发病机制的巨噬细胞及肥大细胞为研究对象,探讨麻黄附子细辛汤组方药材的活性部位及部分有效成分抗过敏性鼻炎的部分作用机制。实验方法1.麻黄附子细辛汤组方药材中活性部位的制备及分析：采用回流提取、浓缩、萃取等方法制备麻黄总碱提取物及附子总碱提取物；采用2010版《中国药典》(一部)水蒸气蒸馏提取细辛挥发油。高效液相色谱法对麻黄总碱提取物及附子总碱提取物中几个生物碱成分的含量进行测定。2.采用MTT法测定不同浓度麻黄附子细辛汤组方药材各活性部位及成分对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖抑制作用。3.以各活性部位及成分对抗原诱导的RBL-2H3进行干预,然后采用酶联免疫吸附法(ELISA法)对细胞因子IL-4, TNF-α,组胺及p-氨基己糖苷酶释放率进行测定。4.以活性部位及成分对抗原诱导的RBL-2H3进行干预,通过提取细胞的总RNA,然后进行逆转录并采用荧光定量PCR方法测定细胞因子IL-4mRNA,TNF-α mRNA的表达水平。实验结果1.活性部位的制备与分析：提取麻黄得到麻黄总碱6.77g,每克相当于麻黄生药量44.4g；提取附子得到附子总碱13.32g,每克相当于附子生药量75g；提取细辛得到细辛挥发油7mL,每毫升相当于细辛生药量42.85g。经HPLC测定,麻黄总碱提取物中含盐酸去甲基伪麻黄碱、盐酸去甲基麻黄碱、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱的含量分别为1.00%,0.99%,23.06%,6.54%,1.97%。附子总碱提取物中含苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头原碱的量分别为1.13%,0.08%,0.07%,0.02%。2.各活性部位及成分对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响：细胞各孔吸光度值大小与细胞活力成正比,数据结果表明,LPS组作用24小时后,与溶剂对照组比,细胞活力明显增加,统计有显著差异(P<0.05),说明LPS作用RAW264.7细胞24小时后能促进细胞活力。LPS分别与100μg/L麻黄总碱提取物组、2.2μl/L细辛挥发油组、苯甲酰次乌头原碱组、苯甲酰乌头原碱组、麻黄碱组、甲基麻黄碱组、伪麻黄碱组共同处理细胞24小时后,各组的细胞活力明显下降,与LPS模型组比,各组细胞活力均降低,统计有显著差异(P<0.05)。此外,附子总碱提取物组、苯甲酰新乌头原碱组、双酯型乌头碱以及去甲基麻黄碱组,各组细胞活力变化与LPS模型组比,无统计学差异(P>0.05)。3.麻黄附子细辛汤组方药材中活性部位及部分有效成分对抗原诱导的RBL-2H3细胞释放细胞因子IL-4, TNF-α,组胺及β-氨基己糖苷酶的影响：所有活性部位及成分均可以抑制β-氨基己糖苷酶的释放,统计有显著差异(P<0.05)；以上成分除次乌头碱与细辛挥发油外均可抑制细胞因子IL-4的释放,统计有显著差异(P<0.05)；附子总碱提取物、伪麻黄碱,去甲基伪麻黄碱、麻黄碱及次乌头原碱可以抑制TNF-α及组胺的释放,统计有显著差异(P<0.05)。4.麻黄附子细辛汤组方药材中活性部位及部分有效成分对细胞因子IL-4mRNA, TNF-α mRNA表达水平的影响：刺激组与正常组比较,IL-4及TNF-α的mRNA相对表达量均有上调作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。与刺激组比较,几个活性部位组(麻黄总碱提取物组,附子总碱提取物组及细辛挥发油组)对IL-4的mRNA相对表达量均有上调作用,其中细辛水煎液的中低剂量组,伪麻黄碱低剂量组,乌头碱中高剂量组及苯甲酰次乌头原碱高剂量组对IL-4的mRNA相对表达量均有下调作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。其他组显示上调或下调作用但并没有统计学差异。与刺激组比较,麻黄总碱提取物,细辛挥发油各组对TNF-a的mRNA相对表达水平均有上调作用,差异具有统计学意义(P<0.05),其他组对TNF-a的mRNA相对表达水平均有下调作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验结论1.巨噬细胞是炎症过程中炎症反应的开始,巨噬细胞在过度激活下可产生各种炎性介质引发炎症反应。麻黄总碱提取物及其有效成分麻黄碱、甲基麻黄碱及伪麻黄碱均具有抑制LPS诱导的RAW264.7细胞活力的作用,麻黄碱、甲基麻黄碱及伪麻黄碱可能为总碱提取物的药效物质。细辛挥发油及其水煎液均有抑制LPS诱导的RAW264.7细胞活力的作用,说明二者均是活性部位,其起作用可能为不同类别的成分。附子总碱提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞活力没有有影响,但其有效成分苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱有此作用,可能由于附子总碱提取物中有效成分含量相对较低所致。麻黄附子细辛汤组方药材部分活性部位及活性成分具有通过抑制过度激活的巨噬细胞来控制其炎症反应。2.肥大细胞激活后,可释放多种生物活性介质和细胞因子,包括IL-4,TNF-a,组胺及p-氨基己糖苷酶。麻黄附子细辛汤组方药材的几个部位及成分对p-氨基己糖苷酶均具有抑制作用,但仅麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱和次乌头碱对组胺的释放有抑制作用,可能因为组胺是属于分泌颗粒中的一种,而这些成分可能只作用于溶酶体。麻黄总碱提取物、附子总碱提取物、细辛水煎液、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、新乌头碱和乌头碱具有同时抑制IL-4, INF-α和p-氨基己糖苷酶释放的作用,说明这些成分可能为麻黄附子细辛汤通过该途径抗过敏性鼻炎作用的部分药效物质。3.麻黄附子细辛汤组方药材各部位及成分对抗原诱导的RBL-2H3细胞IL-4mRNA, INF-α mRNA表达水平的结果表明：细辛水煎液、麻黄碱、伪麻黄碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和乌头碱均有同时抑制IL-4和INF-α基因表达水平的作用,这些部位及成分可能通过抑制二者的基因表达来发挥其抗炎的作用。附子总碱提取物、苯甲酰新乌头原碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱、次乌头碱及新乌头碱仅有抑制TNF-α基因表达水平的作用,它们可能通过抑制INF-α基因表达而发挥抗炎作用。