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1研究背景与目的：
食管癌与贲门癌具有显著的流行病学特征与流行地域分布一致,特别是河南、河北和山西三省交界地区,是中国,也是世界上食管癌和贲门癌发病率和死亡率最高的地区。且食管癌与贲门癌有着相似的发病风险因素,包括营养缺乏、蔬菜水果的低摄入量以及经济不发达等。食管癌和贲门癌发生的分子机制仍不清楚。本课题组通过全基因组关联分析(Genome-wide Association Study,GWAS)研究,发现PLCE1和核黄素转运基因(C20orf54)是食管癌和贲门癌的高易感基因。C20orf54位于常染色体20p13,又称hRFT2,共有5个外显子,编码的蛋白为核黄素转运蛋白,其生物学特征与rat RFT2有83％的相似性,而此基因的生物学功能尚不十分清楚。C20orf54主要功能是将核黄素由细胞外转入细胞内。我国老一代科学家早在70年代就已证实核黄素缺乏与食管癌和贲门癌的发生密切相关,补充核黄素能够降低发病风险。核黄素转运基因变异为食管/贲门癌的预防提供了重要的理论依据。近年来,随着分子生物学技术的发展和应用,人们对肿瘤的发病机制研究早已深入到基因水平,尤其是新兴的外显子测序技术为肿瘤的发病机制研究提供了非常重要的技术手段。很显然,进一步了解该基因的变异特征和规律对阐明食管和贲门癌变分子机制具有重要意义。本课题采用外显子测序技术和免疫组织化学技术,分析核黄素转运基因全部外显子(共5个外显子)在食管/贲门癌和配对癌旁组织中的变化,初步探讨C20orf54外显子的变异与食管癌和贲门癌发生的关系。
2研究材料与方法：
2.1研究材料
研究材料为29例食管癌与配对癌旁、肌肉组织,5例贲门癌与配对癌旁组织。大体标本均为手术切除并经病理证实,且癌旁组织均为正常上皮。大体标本分别制备为冰冻组织和石蜡组织。
2.2患者临床资料收集
研究对象为29例食管癌和5例贲门癌患者,其中男性29例,女性5例,年龄在4l～77岁,平均年龄61.03±8.46岁,分别来自河南省食管/贲门癌高发区(11例)和低发区(23例),所有患者术前均未进行化疗和(或)放疗。临床资料内容包括:个人基本情况,食管癌家族史,详细临床资料等。
2.3组织DNA抽提
常规酚.氯仿抽提法提取冰冻组织DNA。
2.4全基因外显子测序技术及测序结果分析
本课题采用双脱氧链终止法(Sanger dideoxy mediated chain terminationmethod)对C20orf54全基因外显子进行检测。运用Chromas软件和BLAST,dbSNP及Smart数据库分析测序结果。
2.5免疫组织化学方法
采用卵白素.生物素.辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法。
3结果：
3.129例食管癌和5例贲门癌及配对癌旁、肌肉组织测序结果初步分析。
发现29例食管癌和5例贲门癌及配对癌旁组织均存在碱基变化较为频繁的10个变异位点:第3外显子5个变异位点,第2和第5外显子分别是2个变异位点,第1外显子1个变异位点,而第4外显子上未发现变异位点。
3.229例食管癌和5例贲门癌与配对癌旁、肌肉组织测序结果比较
比较食管/贲门癌与配对癌旁、肌肉组织测序结果,发现7种变异类型仅存在于食管/贲门癌组织中,而配对癌旁和肌肉组织中并未发现。仅比较贲门癌和配对癌旁组织测序结果,发现7种变异类型仅存在于贲门癌组织中,配对癌旁组织中并未发现。
3.3食管癌高/低发区食管和贲门癌患者癌与配对癌旁、肌肉组织测序结果比较比较来自食管癌高发区食管和贲门癌患者癌与配对癌旁、肌肉组织测序结果,分别发现6种变异类型仅存在于食管和贲门癌组织中,而在低发区癌与癌旁组织测序结果无明显差别。
3.41139T＞C、1139C＞T和1172C＞T三种特殊变异类型
查询数据库发现1139T＞C、1139C＞T和1172C＞T三种变异类型可引起氨基酸的改变(1139:T→Leu[L],C→Pro[P];1172:T→Met[M],C→Thr[T])。
3.5免疫组化结果
分析22例食管癌和4例贲门癌及其配对癌旁组织免疫组化结果,发现存在变异类型的癌组织,C200rf54的表达多为阳性(87.5%),且存在变异类型的食管癌癌组织,C20ort34的表达均为阳性,存在变异类型的贲门癌癌组织,C20orf54的表达阳性和阴性各占一半,均为胞浆染色。
4结论：
4.1在C20orf54基因外显子中,发现10个碱基变化较为频繁变异位点,提示这10个变异位点可能与食管/贲门癌的发病风险相关。
4.2 C20orf54基因外显子主要变异类型同时发生在食管癌和贲门癌癌组织中,提示这些变异类型可能与食管癌和贲门癌的发生有关,且提示了食管癌与贲门癌有着相似的发病风险因素。
4.3高发区食管/贲门癌与癌旁组织测序结果有差别,低发区无明显差别。提示C20orf54外显子的变异可能与环境相关。
4.41139T＞C、1139C＞T和1172C＞T三种变异类型可引起氨基酸的改变(1139:T→Leu[L],C→Pro[P];1172:T→Met[M],C→Thr[T])。提示这些变异类型为进一步研究C20orf54外显子变异与该基因在食管/贲门癌组织中的表达提供依据。
4.5在食管/贲门癌癌组织中,C20orf54基因外显子变异与蛋白表达的比对结果,为深入探讨两者之间的关系提供理论基础。