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目的:目前以免疫检查点抑制剂为基础的免疫疗法已在多种癌症的治疗中取得巨大成功,并且免疫治疗与化疗、放疗、局部治疗等联合已成为肿瘤综合治疗的重要策略。微波消融(microwaveablation,MWA)是一种微创抗肿瘤治疗方式,能够有效触发T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。MWA联合免疫治疗在一些临床前和临床研究中取得了重要进展。T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸基抑制基序域(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)是具有抑制功能的新型免疫检查点分子。本研究中,我们利用MC38结肠癌荷瘤小鼠模型检测MWA治疗前脾脏淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)中TIGIT表达和MWA治疗前后对侧TILs中TIGIT表达,并探索MWA联合TIGIT抑制剂是否存在协同抗肿瘤作用及机制,以期为MWA联合免疫治疗逆转肿瘤免疫抑制微环境,增强抗肿瘤效果提供新的思路。方法:在本研究中,我们构建了小鼠背部双侧移植瘤动物模型,检测小鼠MWA治疗前脾脏淋巴细胞、TILs中TIGIT表达差异,MWA治疗前后对侧TILs中TIGIT表达差异。我们分析了已发表的MC38结肠癌荷瘤小鼠模型单细胞转录组测序数据(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)、Panc02胰腺癌皮下荷瘤模型消融对侧的scRNA-seq数据,分析TIGIT在消融前后TILs中表达差异。随后,我们选用了 TIGIT阻断型单克隆抗体作为TIGIT抑制剂,通过监测小鼠的肿瘤生长和生存来评估MWA单独或与TIGIT抑制剂联合治疗的抗肿瘤作用。此外,我们还利用流式细胞术检测了TILs的比例和CD8+T、NK细胞中效应分子的表达,并进一步通过CD8、NK抗体清除实验验证了 MWA联合TIGIT抑制剂治疗可通过增强CD8+T、NK功能而逆转免疫抑制。最后,我们构建MC38结肠癌小鼠背部双侧移植瘤模型,设立MWA和MWA联合TIGIT抑制剂治疗组,采用磁珠富集和流式分选纯化肿瘤浸润CD45+免疫细胞,进行scRNA-seq,比较MWA和MWA联合TIGIT抑制剂治疗组之间的不同免疫细胞分群、比例和功能差异,并采用CellChat方法分析淋巴细胞和髓系细胞的细胞间通讯作用,以期进一步探索MWA联合TIGIT抑制剂的协同抗肿瘤作用机制。结果:本研究发现,在MC38荷瘤动物模型中免疫抑制性受体TIGIT在肿瘤浸润CD4+T细胞表达(11.80±2.27%)高于脾脏CD4+T细胞表达(6.52±1.54%),两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。TIGIT在肿瘤浸润CD8+T细胞表达(15.30±0.60%)明显高于脾脏CD8+T细胞表达(4.29±0.26%),两组间比较差异有统计学意义(P<0.0001)。TIGIT在肿瘤浸润NK细胞表达(20.60±1.54%)明显高于脾脏NK细胞表达(9.24±2.40%),两组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。TIGIT在肿瘤浸润Foxp3+Tregs 细胞表达(37.3±6.71%)明显高于脾脏 Foxp3+Tregs 细胞表达(5.06±1.49%),两组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。scRNA-Seq数据分析发现TIGIT在肿瘤浸润CD4+T、CD8+T、NK和Tregs高表达,而且在Tregs表达最为明显。通过构建背部双侧移植瘤模型进行MWA治疗,结果发现MWA治疗后第十天TIGIT在对侧肿瘤浸润CD4+T、CD8+T和NK细胞中表达升高。scRNA-Seq数据分析发现消融后对侧肿瘤的T淋巴细胞中TIGIT的表达上调,而其他免疫细胞上几乎没有表达。MWA联合TIGIT抑制剂治疗可协同抑制远处肿瘤的生长,延长小鼠的生存期,增加 CD45+TIL、CD4+TIL、CD8+TIL 和 NK 细胞的比例,显著增加 IFN-γ+CD8+、TNF-α+CD8+、GZMB+CD8+、CD107a+NK、IFN-γ+NK、TNF-α+NK 的比例,增强远处肿瘤中的CD8+T、NK细胞抗肿瘤免疫反应。scRNA-seq数据分析进一步发现,MWA、MWA联合TIGIT抑制剂治疗的stem-like CD8+T、interferon-induced CD8+T 和 cycling CD8+T 细胞比例无明显差异,而 MWA联合TIGIT抑制剂可显著增加effector CD8+T细胞的比例,减少exhausted CD8+T细胞的比例,并活化了 effector CD8+T细胞中TNF-α、TGF-β、氧化磷酸化和糖酵解反应相关的通路,活化了 exhausted CD8+T细胞中NF-κB介导的TNF-α信号、TGF-β信号、G2/M细胞周期检查点、IFN-γ、脂肪酸代谢、氧化磷酸化、糖酵解途径反应相关的信号通路,进而逆转了 exhausted CD8+T细胞的效应功能。同时,CD8+T细胞中,包括 stem-like、effector、interferon-induced 和 cycling CD8+T 细胞上的趋化因子受体3(CXCR3)的表达升高。MWA、MWA联合TIGIT抑制剂治疗两组髓系细胞主要分群中性粒细胞、单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞1(tumor-associatedmacrophages 1,TAM1)、TAM2、循环巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)比例则无明显差异。而MWA联合TIGIT抑制剂后趋化因子CCL5,CXCL9,CXCL16表达上调,CCL2和CCL7表达下降。同时,MWA联合TIGIT抑制剂治疗后,显著改变了免疫亚群的细胞间通讯,显著减弱髓系细胞之间的相互作用,显著增强T细胞(包括CD4、CD8和Treg细胞)之间的相互作用,显著增强CD8+T细胞中的CCL和CXCL信号,进而增强抗肿瘤免疫。结论:免疫检查点TIGIT与MWA治疗后肿瘤微环境(the tumor microenvironment,TME)免疫抑制的形成密切相关。MWA和TIGIT抑制剂联合治疗可以显著增强远处肿瘤中的CD8+T、NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答,逆转TME中MWA治疗后诱导的CD8+T细胞耗竭,并重塑TME中的髓系细胞功能,显著改变免疫亚群的细胞间通讯,进而发挥协同抗肿瘤作用。MWA联合TIGIT抑制剂治疗是一种新的、具有重要潜在临床应用价值的肿瘤联合免疫治疗策略。