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辣椒是一种风味蔬菜,不仅可以鲜食而且可加工成辣椒粉、辣椒酱等。此外,从辣椒中提取的辣椒素类物质还可以用作生化农药、医药中的镇痛剂等。辣椒素合成途径相关基因启动子的克隆与功能分析,不仅有助于从基因角度了解辣椒素类物质的代谢过程,并能够为实现基因调控辣椒素的生物合成提供必要的基因元件,具有十分重要的理论意义及应用前景。
目前,韩国及美国的科学家已经在辣椒素合成有关基因克隆方面进行了研究。韩国研究者从已知最辣的一种辣椒Habanero(Capsicumchinense)中筛选到39个胎座特异的克隆,将它们分为四类:并预测GroupⅠ中的酶(酰基转移酶和脂肪酸乙醇氧化酶)参与了辣椒素的生物合成。美国研究者Curry,Aluru等(1999,2003),从Habanero(Capsicumchinense)胎座分离到几个与辣椒素生物合成有关的cDNA克隆如Kas(AF085148)、pAMT(AF085149)等,而且这些克隆的转录是胎座特异的。
本研究利用根据Kas基因、pAMT基因的mRNA设计的两套特异性引物与16个随机引物组合,以辣椒基因组DNA为模板对两个基因的上游序列分别进行了TAIL-PCR扩增。在研究中,将TAIL-PCR条件进行优化,共得到14个特异条带,条带大小大多在300-800bp,平均为591bp,最小的片段300bp,最长片段为1305bp。
TAIL-PCR扩增得到的片段与含GUS的植物表达载体连接,成功构建了12个双元植物表达载体。将表达载体转入烟草,12种转化植株均得到成活植株,其中有3个片段的转化植株的幼苗叶片检测到GUS表达。进一步将表达载体转入辣椒,得到8种转化植株,但在转基因辣椒未检测到GUS表达。
对8个成功转入辣椒的表达载体所含片段进行了测序,有7个片段的序列与Genebank上的已发表序列相似性很低,应为本研究克隆到的新序列。这8个序列片段都不同程度含有启动子的结构特征,如转录起始位点及调控元件TATA盒、CAAT盒等。对来自Kas基因的片段进行相似性比较,发现有两个片段相似性很高,尤其是转录起始位点及几个调控元件,TATA盒、CAAT盒附近的序列几乎完全相同,二者相似性达到75%以上。
本研究得到的扩增片段除来自Kas基因的3个片段能启动GUS基因在烟草幼苗叶片中的表达外,其余片段在转基因烟草和辣椒中都没有表现出启动子活性。因此,这些片段可能只是Kas和pAMT基因上游调控区域的部分序列,与调控活性密切相关的部分没有扩增到。也可能是由于转基因沉默等原因,导致这些片段不能启动GUS基因的表达。
本研究对TAIL-PCR技术在植物启动子序列克隆方面的应用进行了尝试,初步证明这一方法在辣椒特异基因启动子克隆方面是有效的。研究中克隆到的启动子片段为进一步克隆辣椒胎座特异启动子,分析其功能奠定了基础。