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菊糖和左聚糖是自然界中的两种果聚糖,果糖基分别通过β-（2,1）和β-（2,6）糖苷键连接。菊糖是一种可溶性膳食纤维,广泛存在于许多菊科植物中。菊糖具有许多优良的生理功能,诸如:促进矿物质吸收、调节免疫系统、抗肥胖、抗糖尿病、促进肠道益生菌增殖等。菊糖还具有许多良好的理化性质,如溶解性、稳定性、增稠性、凝胶性等。因此,菊糖在食品、医药、化妆品等领域有着广阔的应用潜力。微生物菊糖蔗糖酶（Inulosucrase,IS,EC 2.4.1.9）和左聚糖蔗糖酶（Levansucrase,LS,EC 2.4.1.10）可以分别以蔗糖为唯一底物,通过一步反应,直接合成菊糖和左聚糖。这两种果聚糖蔗糖酶在晶体结构、催化机理、反应进程、酶学性质方面有着很多共同点,尤其是乳酸菌属Lactobacillus来源的两种酶。目前国内对于这两种果聚糖蔗糖酶的研究主要集中在LS上,IS的相关研究报告较少,这可能是因为IS的微生物来源较少。目前报道的IS大都来自Lactobacillus,Lactobacillus是一类益生菌。因此,本课题选择Lactobacillus来源的IS为研究对象,构建重组质粒,进行异源表达和酶学性质鉴定,筛选出性质优异的IS;通过理性设计对IS进行改造,提高IS的活力和热稳定性;通过半理性设计,对IS进行产物链长调控,改变产物特异性,定向积累蔗果三糖;解析晶体结构,揭示控制IS和LS糖链延伸的关键残基,提出IS催化多糖和寡糖合成的糖链延伸机制。具体的研究内容和结论如下:（1）新型IS的鉴定。L.jensenii JV-V16和L.psittaci DSM 15354来源的IS在NCBI中的登录号分别为EFH30007.1和KRL62549.1。按照已报道来源于L.johnsonii NCC533和L.gasseri DSM 20604的IS的截断方式,截去部分N-端和C-端序列,构建Laje-IS△93-683和Laps-IS△94-657。将截断蛋白对应的基因序列分别导入载体p ET-22b（+）中,构建重组质粒。转化进感受态细胞E.coli BL21（DE3）中进行异源表达,分离纯化和酶学性质鉴定。Laje-IS△93-683和Laps-IS△94-657的分子量分别为65.6 k Da和63.4 k Da,与理论分子量相符。Laje-IS△93-683的最适p H和温度分别为p H6.0和45℃,Tm值为64.01℃。Laps-IS△94-657的最适p H和温度分别为p H 5.5和45℃,Tm值为53.91℃。二者酶活均受大部分金属离子抑制。Laje-IS△93-683展现出高的热稳定性,60℃下半衰期达14.5 h。以600 g/L的蔗糖为底物,加酶量定为18.2 U/g蔗糖,在p H 6.0和45℃条件下,6 h后Laje-IS△93-683产菊糖的量约为287.4 g/L,蔗糖到菊糖的转化率约为46%。Laje-IS△93-683还展现出高的转糖基能力,转糖基水解比（T/H）为目前已鉴定的IS中最高。以D-木糖、D-麦芽糖和D-海藻糖作为果糖基受体时,生成明显的转糖基产物。（2）IS的食品级表达及微生物菊糖的理化性质鉴定。将L.gasseri DSM 20604来源的IS（Laga-ISΔ138-702）对应的基因插入到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的载体中,构建质粒p UB-P43-IS-dal。导入到敲除D-丙氨酸消旋酶基因的B.subtilis 1A751（dal-）中,利用D-丙氨酸筛选替代抗生素筛选,实现IS的无抗表达。对产物菊糖分离纯化后,进行理化性质鉴定。扫描电镜观察发现微生物菊糖的结构与阿拉伯胶相似,原子力显微镜观察发现其为无分支的长链结构。热重分析显示微生物菊糖的重量损失分为三个阶段,差示扫描量热分析确定微生物菊糖的熔化焓为145.4 J/g,峰值温度为131.6°C,与植物菊糖基本一致。小角度X-射线衍射图在2?=8.21°、16.19°和18.52°处出现弱峰。3%的微生物菊糖溶液具有牛顿流体的特性,6%、9%和12%的微生物菊糖溶液具有非牛顿流体剪切变稀的特性。3%的微生物菊糖溶液即可展现出凝胶性,且凝胶强度随着浓度的增加而增加。此外,微生物菊糖比植物菊糖展现出更好的储藏稳定性。（3）截断突变提高IS的活力。按照最广泛研究的截断方式构建L.reuteri 121来源的IS和LS,分别为Lare121-ISΔ121-701和Lare121-LSΔ103-686。再此基础上研究N-端和C-端区域对酶活性和稳定性的影响。分别构建Lare121-ISΔ177-701和Lare121-LSΔ154-686（截断N-端柔性区域）,Lare121-ISΔ207-701和Lare121-LSΔ186-686（进一步截断N-端柔性区域）,Lare121-ISΔ121-676和Lare121-LSΔ103-654（截断C-端柔性区域）,Lare121-ISΔ177-676和Lare121-LSΔ154-654（同时截断N-端和C-端柔性区域）。发现截断N-端柔性区域的Lare121-ISΔ177-701和Lare121-LSΔ154-686展现出最高的酶活,但产物链长分布变化不大。按照Lare121-ISΔ177-701和Lare121-LSΔ154-686的截断方式构建其他Lactobacillus来源的IS和LS,发现了普适性的N-端截断的酶活促进效应。但N-端对Lactobacillus来源的IS和LS的热稳定性的影响不具有统一规律,因酶的来源而异。（4）定点突变提高IS的热稳定性。通过基于进化基础的位点优化策略和基于特殊区域的局部改造策略。对Laga-ISΔ138-702进行分子改造,以提高其热稳定性。从11个位点中,筛选出4个Tm值提高1℃以上的突变体A466E、S482A、I614M和A627S。选择特定位点,采取定点突变,组合优势突变,应用截断突变,获得的四点突变体M4N-33,其Tm值比野生酶提高了6.2℃,在55℃下的半衰期提高了120倍。M4N?33的最适p H与Laga-ISΔ138-702保持一致,最适温度提高了5℃。最适条件下M4N-33的酶活较Laga-ISΔ138-702提高了52%,且M4N?33的菊糖产量基本不变。分子动力学模拟显示,突变体M4N-33降低了蛋白表面loop的灵活性,使得酶热稳定性提高。（5）定点突变改变IS的产物特异性。以Lare121-ISΔ121-701为研究对象,通过半理性设计,筛选并构建突变体以控制产物的链长,定向合成蔗果三糖（1-kestose）。发现Arg541和Arg544对于产物链长分布影响较大。其中Arg541突变体的酶活损失严重,Arg544的饱和突变体较野生酶均能产生更多的1-kestose。尤其是突变体R544W改变了IS的产物特异性,产生了以1-kestose为主要成分的短链低聚果糖（Sc FOS）。分子动力学模拟验证了R544W与1-kestose的结合自由能比野生型酶与1-kestose的结合自由能更高,这使得1-kestose不易结合在催化口袋,而被进一步延伸,从而实现1-kestose的积累。对突变体R544W产1-kestose的反应进行条件优化,使得1-kestose和总Sc FOS的产量最大分别达到206 g/L和307 g/L。（6）IS的晶体结构及产物延伸机制解析。以Lare121-ISΔ121-701和Lare5448-LSΔ145-698为研究对象,通过X-射线衍射获得Lare121-ISΔ121-701及其突变体IS-R544W的高质量晶体结构。通过分子对接和结构比对,发现处于IS和LS的相同位置的9个位点。设计并构建这些位点的丙氨酸和色氨酸取代突变体,36个突变体对IS和LS产物分布的影响存在相同点和不同点。通过结构分析和突变体产物链长分布分析,发现IS存在4个潜在的糖链延伸通道,且突变位点可分为两个残基群。残基群1分布在通道2附近,控制IS合成多糖;残基群2分布在通道4附近,控制IS合成寡糖。然而,两个残基群都控制LS合成寡糖。进一步提出IS催化多糖和寡糖合成的双“U”型糖链延伸机制。