论文部分内容阅读
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)作为一种肠肽激素，具有血糖依赖性促胰岛素分泌等多种生理功能，在2型糖尿病的临床治疗中具有较好的应用前景。但由于体内二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的快速降解和肾脏代谢作用，导致其半衰期很短，使临床应用受到了很大限制。因此，开发更稳定的GLP-1类似物，延长其体内有效作用时间就成为近年来关注的一个热门课题。
本文首先构建含有大鼠GLP-1受体(GLP-1R)基因的重组表达载体pcDNA3.1(+)/GLP-1R，并转染含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CHO/EGFP细胞，经抗性筛选、单克隆化和功能性分析，得到了稳定转染的单克隆细胞系CHO/EGFP/GLP-1R。与阴性对照细胞相比，该细胞系能功能性表达GLP-1R并且通过与cAMP偶联的EGFP报告基因表达量来反映受体的激活情况。经考察检测EGFP表达的最佳时间为8 h，：EGFlP的表达量与GLP-1的浓度有良好的相关性，其EC<,50>值为0.74 nmol/L。该功能性报告基因细胞分析系统不仅可以用于GLP-1R激动剂的高通量筛选，而且可以对GLP-1R激动剂的体外活性进行定量分析，为研究和开发长效GLP-1类似物奠定了方法学基础。
利用上述细胞模型筛选噬菌体随机12肽库。经过四轮筛选，与细胞表面GLP-1R结合的噬菌体得到了富集，回收率提高了1，500倍。随机挑取1，000个噬菌体克隆，经噬菌体ELISA鉴定和功能性筛选，45％的噬菌体克隆能够与细胞结合，28％的噬菌体克隆能够被GLP-1竞争下来，仅有10个克隆(1％)能够刺激CHO/EGFP/GLP-1R细胞产生.EGFP表达。10个阳性噬菌体克隆序列分析结果显示为三组序列，分别对应于GLP-1三个不同区域的氨基酸残基(Group 1：23-34；Group 2：18-29；Group 3：6-17)。根据定位于GLP-1 N端区域的第3组序列合成了 GLP-1 模拟肽 KS-12 (KHADGSFITEAS)和它的类似肽HS-11(HADGS FITEAS)，以及GLP-1的N端多一个Lys的类似物KGLP-1。体外活性分析结果显示，KS-12和HS-11均能以剂量依赖的方式激活GLP-1R，但其EC<,50>值比天然GLP-1和KGLP-1高约1，000倍。而体外稳定性分析结果表明，与GLP-1和HS-11相比，KS-12和KGLP-1具有显著的抗DPP-Ⅳ降解作用，与DPP-Ⅳ粗提物作用12 h后仍能保持83％和80％的活性。进一步体内活性分析结果表明，KS-12能以剂量依赖的方式显著降低小鼠体内的血糖水平，并且在相同的剂量下，给药1 h后仍具有明显的降血糖作用。然而，天然GLP-1在给药1 h后则未能显示明显的降血糖作用。
其次，本文利用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)作为融合标签，构建了5种GLP-1与SPA以不同形式连接的融合蛋白，并在大肠杆菌BL21中得到了正确表达。米用CHO/EGFP/GLP-1R细胞对纯化后的融合蛋白进行的体外活性评价结果表明，5种融合蛋白均具有GLP-1R激动剂活性，但活性均低于天然的GLP-1。将SPA融合在GLP-1的C端与融合在N端相比，能提高融合蛋白的活性。在二者之间加入不同长度(GGGGS)重复序列，有助于融合蛋白活性的提高，但间隔序列的长度对活性的影响没有显著差别。以上实验结果，为进一步研究和构建长效GLP-1融合蛋白提供了理论依据。根据上述结果，本研究进一步构建了GLP-1及其类似物KGLP-1与人血清白蛋白(HSA)的分泌型融合表达载体pPIC9K/GLP-1/HSA和pPIC9K/KGLP-1/HSA。将其转化P. pastoris GS115后，经His营养缺陷型培养基和G418抗性筛选，分别得到两组高抗性重组子分别命名为重组菌株P.pastoris GS115/GLP-1/HSA和GS115/KGLP-1/HSA。对两组重组菌株进行小规模诱导表达，结果显示融合蛋白GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA在P.pastoris中最高表达量分别为58.5和75.6 mg/L。利用偶联有抗HSA抗体的免疫磁性纤维素微球对发酵液中的GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA进行分离纯化。经一步免疫磁性分离，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA的回收率分别为90.6％和95.6％，纯度分别提高了72.8和55.2倍。SDS-PAGE分析表明，纯化后的融合蛋白呈现单一条带，其纯度分别为96.1％和95.6％。进一步的体外活性分析结果表明，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA均具有与GLP-1相似的GLP-1R激动剂活性，EC<,50>值分别为96和3 14 nmol/L，但其活性明显低于天然的GLP-1。
利用以上构建的P pastoris GS115/GLP-1/HSA和GS115/KGLP-1/HSA重组菌株，在10L发酵罐水平进行发酵表达，其表达量分别为63.6和84.2 mg/L。含有GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA的发酵上清液经中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤一系列纯化过程，其纯度分别提高了69.1和55.6倍，总收率分别为16.0％和20.5％。SDS-PAGE分析表明纯化后的融合蛋白呈现单一条带，HPLC分析结果显示其纯度分别达到95.8％和93.9％。通过MALDI-TOF-MS确定融合蛋白分子量分别为70，169.2 Da和70，297.8 Da，与预计的分子量一致。体内活性分析结果表明，GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA能以剂量依赖的方式显著降低小鼠体内的血糖水平。虽然GLP-1/HSA和KGLP-1/HSA在给药后1 h才表现出明显的降血糖作用，但该作用可以分别维持4 h和8 h，而天然GLP-1的降血糖作用在给药后1 h即消失。以上结果表明，将GLP-1及其类似物与HSA进行融合表达，能明显地减缓其体内代谢清除率，延长其体内有效作用时间。
本论文以GLP-1R为靶点构建了含有EGFP报告基因的功能性细胞分析系统，以此作为GLP-1R激动剂体外活性分析和高通量筛选的模型。利用该模型在噬菌体展示随机肽库中进行功能性筛选，得到了具有抗DPP-Ⅳ降解作用的GLP-1模拟肽。同时，利用融合表达技术在毕赤酵母中表达GLP-1及其类似物与HSA的融合蛋白，延长了其体内作用时间，为开发能够用于2型糖尿病临床治疗的长效GLP-1药物奠定了基础。