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随着社会发展以及人们生活水平的提高,由血栓引起的血栓性疾病是一种常见心脑血管病。每年在我国需要进行血栓溶解治疗的人就超过300万,而死于心脑血管疾病的人每年大约为200万,占总因病死亡人数的40.7%,与癌症相比,位于各类死因之首。因此,作为威胁人类健康的疾病,心脑血管疾病已成第一位。溶栓剂作为一种治疗血管疾病的抗栓药物,其作用机理主要通过激活纤维蛋白溶解酶原活化成为纤维蛋白溶解酶,使之催化血栓的基质纤维蛋白水解；另外一些溶栓剂也可直接水解纤维蛋白,同样使血管再次通畅。及时给予溶栓剂的治疗,使闭塞血管再通,重要脏器迅速获得血液再灌注,扼制脏器衰竭的发生是很好的治疗方法。因此,效果良好、溶血副作用小的溶血栓药物的寻找和研制,对于有效地治疗和拯救人类于心脑血管疾病具有十分重要的意义。黄粉虫(Tenebrio molitor L.)。体内多种蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等物质,经实验证明,以黄粉虫为原料制成的保健品可提高人体免疫力,抗疲劳,降低血脂,抗癌,促进新陈代谢等功效。国内主要研究其在饲料中应用,作为一种高蛋白营养品,对其蛋白的功能以及功能性蛋白的研究较少。在国外,现阶段对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取、功能,以及其基因方面的研究不多,而对该基因的克隆表达的研究还没出现。本研究是对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(TMTLSP)进行全基因克隆以及原核表达。首先,分别利用异硫氰酸胍法和柱式小量提取法提取黄粉虫总RNA,比较两种提取方法在含量、纯度、完整度上的优异,以获得高质量的黄粉虫总RNA,为下一步实验做准备。然后,参照地鳖(Eupolyphaga sinensis)纤溶酶(fibrinolytic enzyme)基因序列的简并引物,进行温度梯度PCR。以得到的扩增产物为基础,采用Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)法扩展蛋白基因全长cDNA,并命名为黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶(Tenebrio molitor Trypsin-like Serine Protease, TMTLSP)。 TMTLSP全长为869bp(GenBank序列号为JN662461),开放阅读框为777bp,编码258个氨基酸,并具有Trypsin-like特有的起始位点、活性中心以及预计底物结合位点。经过比对分析,该基因编码的氨基酸序列与多种昆虫如赤拟谷盗、谷蠹、光亮扁角水虻、美洲大蠊的胰蛋白酶或丝氨酸蛋白酶有较高的相似性。同时对利用pET28a(+)、大肠杆菌BL21原核表达体系对黄粉虫胰蛋白酶样酶进行原核表达,再进行目标蛋白的纯化以及初步复性。为丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取以及研究提供更为广泛的研究材料以及研究依据。