【摘 要】
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目的:本研究采用基因重组技术,构建猪囊尾蚴cYI基因原核表达载体,观察其在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究cYI基因的蛋白质结构和功能,从而为开发囊虫病特异性诊断抗原和
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目的:本研究采用基因重组技术,构建猪囊尾蚴cYI基因原核表达载体,观察其在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究cYI基因的蛋白质结构和功能,从而为开发囊虫病特异性诊断抗原和基因疫苗提供理论依据。方法:1目的基因的获得:以本室保存的猪囊尾蚴进行RNA的提取,根据已知基因序列设计引物,进行RT-PCR,条件为:37℃50 min ,94℃预变性5min,按94℃1min,56℃1min,72℃1min进行30个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存备用。2重组质粒转化感受态菌DE3:RT-PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化,用NdeI及XhoI末端修饰后与经相同酶消化、回收的原核高效表达载体pET28b进行体外定向重组,连接产物转化感受态菌DE3,同时设立对照组,在含卡那霉素的LB固体培养基中培养,挑选白色单一菌落,按碱裂解法提取质粒后进行双酶切,鉴定是否含有插入片段。3重组表达:将含有目的基因的阳性菌于37°C活化后转种到LB(含卡那)液体培养基中。次日按1:100的比例转种到LB(含卡那)液体培养基中继续在37°C振荡培养至对数生长中期,分别于诱导前,诱导后1h、2h、3h、4 h取菌液1ml,离心,收集菌体并用TE Buffer悬浮。
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