寄主植物的自噬反应对番茄斑萎病毒的抗性机制研究

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细胞自噬(Autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质通过降解进行周转的重要过程,通过该过程细胞质成分包括蛋白质和功能性细胞器被递送至溶酶体或液泡中进行降解。在植物中,自噬在发育、繁殖、新陈代谢、激素信号传导、细胞死亡、衰老以及对非生物和生物胁迫的响应中起着至关重要的作用。自噬在植物与病毒相互作用期间,在调节免疫相关的细胞死亡,抗病毒和促进病毒发病中起重要作用,但是自噬对番茄斑萎病毒有何作用还并不清楚。番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是一种植物多分体负义链RNA病毒,是番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的重要成员,属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。在布尼亚病毒科的五个属中,番茄斑萎病毒属是其中唯一侵染植物的一个属,在世界范围内农业生产上造成严重的危害。为了研究TSWV侵染植物后自噬对病毒起到的调控机制,本论文对TSWV侵染的拟南芥高通量转录组进行了分析,发现病毒侵染后自噬相关(ATG)基因出现大量上调。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测到自噬相关基因AtATG5和AtATG7的表达量在TSWV侵染以后显著上调。在TSWV侵染拟南芥后在显微镜下观察到叶片中自噬小泡(autophago some)的数量大量增加。单独过表达番茄斑萎病毒的各蛋白组分都能激活自噬,并且过表达NSs蛋白产生自噬小泡数量最多。因此,番茄斑萎病毒的侵染激活了寄主植物自噬反应。通过病毒诱导的基因沉默显示,自噬相关基因NbATG5和NbATG7的沉默降低了植物对TSWV病毒的抗性,因此,寄主植物的自噬反应对番茄斑萎病毒具有抗病毒的作用。通过双分子免疫荧光技术(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)分析发现,自噬的核心成分AtATG6可以与NSs蛋白体内互作,并且过表达AtATG6可以抑制NSs蛋白的基因沉默抑制子活性。通过亚细胞定位研究,在激光共聚焦显微镜下观察到AtATG6和NSs的复合体可以定位到自噬小泡上。利用Western blot检测显示,AtATG6可以降解NSs,此外还发现AtATG6可以降解N。通过BiFC和Co-IP分析,AtATG6还与移动蛋白NSm互作。利用番茄斑萎病毒移动mini-replicons反向遗传学体系,过表达AtATG6可以影响病毒的胞间移动。这些结果表明自噬基因AtATG6在TSWV侵染植物期间发挥重要的抗病毒调控机制。研究结果揭示了自噬在植物与多分体负义链RNA病毒相互作用中的抗病毒调控机制,增进了对负义链RNA病毒与植物自噬之间的相互关系的认识。
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