产碱杆菌Alcaligenes sp.DN25是本实验室筛选获得的一株具有高效降氰能力的菌株,该菌对pH和高浓度氰的良好耐受能力使其在生物修复含氰废水中具有潜在应用价值。研究菌种对氰化物的代谢特性,结果显示,该菌种不仅能利用氰化钾为唯一氮源进行生长,还能利用乙腈、硫氰酸钾和亚铁氰化钾等作为氮源。菌种的降解速率和生长情况与环境pH、初始氰浓度及接种量等有关。该菌在pH7-9的范围内降解效果良好,在最适pH8下能在12h内将浓度为43mM的氰化钾(相当于1,100ppm CN-)降解至8.3μM,在接种量为5%,氰浓度达到25mM时,初始降解速率达到最大值14.58mM·h-1；通过生长抑制实验还发现细菌在氰环境中生长存在最低抑制浓度。细菌能在解毒之后利用代谢产物甲酰胺和氨作为生长氮源,认为这与菌体自身的氰水解途径有关。成功克隆了产碱杆菌DN25的降氰酶基因cdE并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了降氰酶的活性表达,测序结果表明该降氰酶基因由一个长度为1005bp的开放读码框组成,降氰酶蛋白由335个氨基酸构成,理论分子量大小约为37kDa。 SDS-PAGE电泳图分析结果表明融合蛋白分子量在38kDa左右。通过诱导表达优化的实验,获得降氰酶的最佳诱导条件分别为,温度28℃,IPTG浓度0.8mM,诱导表达12h,初始OD600=0.6。使用镍柱亲和层析一步纯化获得的重组降氰酶,纯度达到95%以上。氰在纯酶的水解作用下完全转化为甲酸、氨和甲酰胺,而甲酰胺水解的实验又进一步证明了氰水解体系中生成的甲酸并不是来源于甲酰胺的二次水解。这一结果意味着产碱杆菌DN25胞内的降氰酶可能同时催化两种水解途径,使得氰能被降解同时生成甲酸、氨和甲酰胺。这种情况在目前的研究报道中尚属首例。