麦角硫因是一种天然氨基酸,具有抗氧化,清除体内自由基,维持体内氧化还原平衡等功能,是机体内重要的生理活性物质。麦角硫因凭借其独特的抗氧化性在食品、药品、化妆品、医疗卫生等方面应用广泛。尤其在治疗神经类疾病、保护内脏以及生物医用学材料等领域具有广阔的应用前景。甲基杆菌是一种可以利用甲醇作为唯一碳源的微生物,可以将廉价的甲醇转化为更具商业价值的其他化合物,实现资源的合理利用,尤其可以缓解微生物细胞工厂“与人争粮”的压力。前期研究表明,麦角硫因可以由甲基杆菌发酵合成,然而当前报道的产量很低。因此,本研究以甲基杆菌（Methylobacterium oryzae）为研究对象,利用适应性进化方法获得耐高浓度甲醇菌株,提出一种通过检测麦角硫因特征吸收峰的方法作为高通量筛选的策略,便捷高效地筛选出ARTP诱变后的麦角硫因高产突变菌株。同时,对菌株的培养条件和发酵过程进行优化,以确定最佳培养基组成和发酵条件,进一步强化甲基杆菌合成麦角硫因的能力。此外,为进一步验证甲基杆菌生产麦角硫因的能力,将甲基杆菌中麦角硫因合成基因外源导入大肠杆菌中,通过凝胶电泳检验基因的表达情况,将改造后的菌株进行发酵验证麦角硫因产量,侧面验证甲基杆菌中麦角硫因合成基因的催化能力。本文主要研究结果具体如下:1.以M.oryzae为出发菌株,利用全自动高通量微生物液滴培养仪中适应性进化模块对菌株进行耐受甲醇驯化,得到可以耐受40 g/L甲醇浓度的耐受菌株M.oryzae-33。确定30 h为菌体液滴在全自动高通量微生物液滴培养仪中的传代时间,依次设置30、35、40、45 g/L的甲醇浓度,每个浓度连续传代4代。在甲醇浓度为45 g/L时,液滴生长受到较大抑制,说明该浓度已接近菌株耐受极限,此时将6个生长较优的液滴进行提取,在40 g/L甲醇浓度下验证驯化菌株的生长状况,随后在40 g/L甲醇浓度下进行发酵验证其麦角硫因产量,通过筛选最终得到了一株可以在40 g/L甲醇条件下生长且麦角硫因产量为12.37 mg/L较原始菌株提高35.9%的菌株（M.oryzae-33）。2.利用ARTP诱变方法对M.oryzae-33进行诱变,并建立可以高效快速地筛选麦角硫因高产突变菌株的高通量筛选方法。利用麦角硫因的抗氧化作用,选取50 mg/L的高锰酸钾作为初步筛选的条件,确立了麦角硫因浓度与254 nm处吸收波长之间的线性关系,同时验证发酵培养基成分对254 nm处麦角硫因的吸收波长无影响,并以此建立起诱变菌株的高通量筛选方法,即诱变菌株利用深孔板发酵处理后,通过酶标仪进行OD254检测,选取OD254高的进行摇瓶复筛。确立80 s为ARTP诱变处理时间,通过ARTP诱变高通量筛选,最终得到一株麦角硫因产量较亲本提高37.5%的高产菌株（M.oryzae-336）,并对其连续传代6代后验证EGT产量均稳定在16 mg/L左右,确定其具有遗传稳定性。3.根据M.oryzae的生长特性以及麦角硫因的合成特点,依次对发酵过程中的氮源、碳源、金属离子、微量元素等进行优化。通过摇瓶发酵验证得知,复合氮源、复合碳源以及Fe2+对麦角硫因的产量具有重要影响,得到最佳培养基条件为酵母浸粉2.5 g/L、氯化铵8 g/L、甲醇30 g/L、木糖8 g/L、硫代硫酸钠4 mg/L、硫酸亚铁4 mg/L、磷酸吡哆醛6 mg/L,原始菌株EGT产量达到23.9 mg/L较优化前EGT产量提高约4.5倍。M.oryzae-336在优化后产量最高达到35.6 mg/L较同一条件下原始菌株EGT产量提高48.9%。随后又对5 L罐发酵条件进行验证,得到发酵的p H控制策略为控制初始p H值为7.0,后期自然下降至5.5后恒定控制在该水平。补料方式为甲醇浓度低于10 g/L时,一次性补入甲醇10 g/L,该补料方式下EGT产量较批发酵提高52.6%。4.在大肠杆菌中异源搭建麦角硫因合成路径。将M.oryzae中麦角硫因合成相关的5个基因Egt ABCDE依次构建到载体p ET21上,并导入大肠杆菌BL21中。通过检测蛋白表达情况证实5个基因均可以在BL21中进行表达,LC-MS确定重组菌株中麦角硫因的存在,摇瓶发酵后检测发现麦角硫产量可达到20.6mg/L,较甲基杆菌原始菌株初始产量具有显著提高,侧面验证甲基杆菌中麦角硫因合成基因的催化能力显著。