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背景:近年来,高血脂、肥胖等代谢性疾病以及心脑血管事件发生率显著增加,甚至呈现年轻化趋势,其中美国脏学会的报告表明全球每死亡3人中,就有1个死于与心脑血管相关疾病;随着人们生活方式、饮食习惯及我国人口年龄结构改变,动脉粥样硬化(AS)相关性心脑血管疾病致死、致残问题日益突出,并给社会和家庭带来沉重负担。因此,关于AS相关性心脑血管疾病的研究较过去更为必要与迫切。大量流行病学研究数据统计分析显示,寒冷刺激与心脑血管疾病发生之间存在密切关系。对心脑血管疾病患者死亡数据统计分析,发现冬季心脑血管疾病死亡率或死亡危险程度与温度降低具有明显相关性,但其机制并不明确。有人提出寒冷通过引起血管收缩或其他机制升高血压导致心脑血管事件发生,但该观点无法解释关于冷刺激后未监测到血压变化的人群的发病原因。较多基础研究认为冷刺激是通过升高血脂、诱发血管局部炎性反应从而加重AS斑块,导致心脑血管事件发生率增加;但也存在另一种相反观点提出,根据冷刺激时间长短不同,可分为间歇冷刺激(每天仅刺激几个小时)与持续冷刺激(每天24h持续不断刺激),二者可能通过调节炎性因子分泌,对AS斑块形成产生不同影响:前者加重小鼠血管斑块形成,后者可能减轻斑块病变;该观点与2016年发表在“Cell Metabolism”上的基础研究报道的规律一致。可见目前关于寒冷对血脂及AS相关性疾病的影响,尚无定论。脂肪组织作为人体的内分泌器官,其状态对血脂水平起到决定性作用。哈佛大学Spiegelman教授提出,在一定条件下,人体内白色脂肪细胞会发生棕色化(BRITE,即白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化),促进棕色化标志性蛋白解偶联蛋白1(UCP1)表达,该过程可诱发脂肪代谢分解增加从而减轻血脂相关代谢性疾病。多数研究证实BRITE可由运动、薄荷醇刺激及寒冷刺激引发,前两者有利于降低血脂并减肥,于是我们猜想,寒冷是否也可通过引起BRITE从而降低血脂并对AS斑块产生影响。统计结果显示,寒冷环境可使人体TC、LDL-C、TG水平发生不同程度改变,并引起高脂血症发病率明显升高,提示寒冷与血脂水平之间存在关联,但相关临床研究较少,该关联表现为何种规律及其发生原因并不确定,并且,该过程是否与寒冷环境中心脑血管事件发生率增加有关仍无定论。为了研究寒冷刺激对人体血脂水平的影响,我们设计临床试验,收集冷刺激前后受试者血脂水平变化的数据;同时为了佐证血压与寒冷导致心脑血管事件发生的相关性,我们进一步监测受试者血压及AngⅡ水平。在此临床试验基础上,我们通过给小鼠施加持续冷刺激,探索其对脂肪组织结构功能改变、血脂水平、炎症反应、AS斑块形成等方面的影响及其作用通路。另外,肥胖是导致动脉粥样硬化的重要因素,有研究认为薄荷醇刺激可以减肥,但并未继续讨论其对AS斑块产生方面有无影响,我们在第二部分基础实验中拟观察薄荷醇对AS斑块的影响,探索传统中药薄荷的主要提取物薄荷醇在AS斑块治疗领域的可能性。方法:试验一(临床试验):招募并筛选9名符合入组条件的受试者,签署试验知情同意书,使受试者穿着统一厚薄单衣在18℃冷环境静处2小时(温度设置参照董梅的文章“冷刺激活化的棕色脂肪对动脉粥样硬化病变的影响和机制研究”),检测冷环境刺激前后受试者血脂、血压、AngⅡ等水平,对结果进行统计分析。实验二(基础实验):根据实验不同要求,将ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠随机分组,分别于30℃及4℃环境饲养,记录小鼠体重及C57BL/6J小鼠进食量,完成相应刺激条件后,收集待检测样本:将血清分离后备存于1.5ml离心管,保存在-80℃;根据后续需要进行分子生物学还是病理染色方法检测,将取材组织分别备存于液氮或者4%多聚甲醛溶液中进行固定。采用生化法检测血脂水平;通过免疫组化法,对各部位脂肪组织及主动脉根部血管石蜡切片使用不同一抗,进行目的蛋白及相应炎性因子表达情况检测;通过HE染色法观察各部位脂肪细胞形态、着色等变化以明确脂肪组织棕色化及棕色脂肪组织活化情况,同时观察主动脉根部斑块形成情况;并通过Western Blot法检测各部位脂肪组织中UCP1蛋白的表达水平,最后对数据进行统计分析。结果:试验一(临床试验):寒冷刺激具有升高人体TC、LDL-C水平的趋势,但结果不具有统计学差异;冷刺激对人体TG水平无显著影响;冷刺激有升高血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及血压(BP)水平的趋势,但对AngⅡ及收缩压升高结果无统计学差异、对舒张压升高结果有统计学差异。实验二(基础实验):1.4周/8周持续冷刺激对小鼠白色脂肪组织棕色化及棕色脂肪组织活化的影响对ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠脂肪组织进行HE染色,发现与30℃对照组相比,4周/8周冷刺激组小鼠腹股沟脂肪组织(sWAT)及肩胛脂肪组织(iBAT)脂肪细胞体积减小、数目增多、伊红染色变深,免疫组化UCP1阳性染色加深,Western Blot检测UCP1蛋白表达量显著增加;然而,4℃组附睾脂肪组织(eWAT)与30℃相比,仅出现极轻微的细胞体积变小、数目增多,HE染色仅轻度着色;免疫组化UCP1阳性染色并未增加。2.4周/8周持续冷刺激对小鼠体重、血脂水平的影响与30℃对照组相比,4周/8周持续冷刺激明显减轻C57BL/6J小鼠小鼠体重,但对ApoE-/-小鼠体重无显著影响;4周/8周持续冷刺激明显降低C57BL/6J小鼠血脂水平;4周持续冷刺激升高ApoE-/-小鼠TC、LDL-C水平,降低TG水平,8周持续冷刺激对ApoE-/-小鼠TC、LDL-C水平无显著影响,但使TG水平降低。3.8周持续冷刺激减轻ApoE-/-小鼠炎性反应、降低AS斑块面积与30℃对照组相比,8周持续冷刺激降低ApoE-/-小鼠血管内CD31、MCP1、MMP2等炎性因子表达,同时明显减少AS斑块面积。4.4周/8周薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠脂肪组织的影响HE染色法观察到,4周/8周薄荷醇刺激引起ApoE-/-小鼠腹股沟及肩胛脂肪细胞形态变小、数目增多、伊红着色变深,而对附睾脂肪细胞形态大小、数目影响并不显著。免疫组化法可观察到8周薄荷醇刺激引起肩胛脂肪组织UCP1阳性染色增加,但对腹股沟UCP1仅轻度阳性染色,对附睾脂肪组织UCP1染色无显著影响;4周薄荷醇刺激引起腹股沟脂肪组织UCP1阳性染色。5.薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠血脂水平以及AS斑块的影响与30℃对照组相比,4周薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠TC水平及LDL-C水平无显著影响,但显著降低TG水平。8周薄荷醇刺激降低ApoE-/-小鼠TC、LDL-C、TG水平;8周薄荷醇刺激显著降低斑块面积。6.4周/8周持续冷刺激及薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠脂肪组织TRPM8表达的影响4周持续冷刺激/薄荷醇刺激均引起ApoE-/-小鼠sWAT的TRPM8阳性染色。8周持续冷刺激/薄荷醇刺激使ApoE-/-小鼠sWAT及iBAT的TRPM8阳性染色面积轻度增加;4周/8周冷刺激或薄荷醇刺激对ApoE-/-小鼠eWAT的TRPM8表达无显著影响。结论:试验一(临床试验):1.冷刺激升高人体TC、LDL-C水平作用不显著,冷刺激对人体TG水平无显著影响;2.冷刺激升高收缩压作用不显著,冷刺激可升高舒张压;3.冷刺激升高血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用不显著。实验二(基础实验):1.4周/8周冷刺激可引起ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠腹股沟白色脂肪组织棕色化(BRITE)、肩胛棕色脂肪组织活化,对附睾白色脂肪组织影响不显著。2.4周/8周冷刺激可引起ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠血脂水平降低。3.8周冷刺激可减轻ApoE-/-小鼠血管斑块局部炎性反应。4.8周冷刺激显著降低ApoE-/-小鼠AS斑块面积。5.4周/8周冷刺激可降低C57BL/6J小鼠体重,4周/8周冷刺激对ApoE-/-小鼠体重无显著影响;8周冷刺激增加C57BL/6J小鼠进食量。6.8周薄荷醇刺激引起ApoE-/-小鼠腹股沟脂肪组织棕色化,肩胛脂肪组织活化;对附睾脂肪组织影响不显著。7.8周薄荷醇刺激降低ApoE-/-小鼠血脂水平及AS斑块面积。