家蚕是一种重要的经济昆虫,对我国国民经济的发展做出了巨大贡献。家蚕在繁殖过程中常受到各种病原微生物的挑战,是研究昆虫与病毒相互作用的良好模式生物之一。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,Bm NPV)是危害养蚕业的主要病原之一,家蚕一旦感染便导致大批死亡,严重影响蚕业的可持续性发展。为控制Bm NPV感染,开发抗病家蚕品种,安全利用成本效益高的生物反应器,研究者们进行了大量的研究,试图揭示家蚕与Bm NPV的相互作用机理,但到目前为止,其机制仍不详。热激蛋白90(Heat shock protein,Hsp90)是一种高度保守的分子伴侣,负责关键蛋白的正确折叠与成熟,在多种生命过程中发挥重要功能。近年来,越来越多的证据表明,Hsp90在许多DNA病毒或RNA病毒的复制中起着至关重要的作用,但目前有关Hsp90在家蚕病毒感染中的作用研究很少。本研究采用蛋白活性抑制剂格尔德霉素(Geldanamycin,GA)抑制家蚕Hsp90蛋白的活性,比较分析了GA处理组与对照组家蚕细胞中Bm NPV的增殖情况。通过在细胞内敲降和蚕体中过表达hsp90基因,进一步分析Hsp90在Bm NPV感染中的作用。此外,为了探讨Hsp90在家蚕与Bm NPV之间的互作机制,我们还采用基于串联质谱标记(TMT)的定量蛋白质组学分析方法,比较了经GA处理组和对照组细胞感染Bm NPV后的蛋白表达差异。主要研究结果如下:1.GA适宜浓度及添加方式的确定不同浓度GA处理Bm N细胞后,经MTT比色法分析表明,采用2.5μM及其以下浓度GA处理Bm N细胞时,对细胞存活率无明显的不良影响。采用GA(1μM和2.5μM)和含有绿色荧光蛋白(e GFP)标记基因的Bm NPV病毒以不同的组合处理Bm N细胞,病毒滴度实验结果表明,GA处理家蚕细胞后病毒滴度与对照组相比低了2个数量级。从病毒抑制效果和操作性上来说,同时添加2.5μM GA和Bm NPV病毒液的方式来处理Bm N细胞效果最佳,因而后续实验均采用该方法处理细胞。2.GA抑制Hsp90蛋白活性对Bm NPV增殖的影响采用绝对q RT-PCR分析不同时间点病毒基因ie-1、lef-3和gp64的拷贝数,结果发现各个病毒基因拷贝数随时间增加而递增;相同时间点内,对照组的病毒基因拷贝数均显著高于GA处理组;Western Blot检测结果显示,GA处理组中Bm NPV核衣壳蛋白39(VP39)的表达量显著低于对照组。结果表明,抑制Hsp90蛋白活性可显著抑制Bm NPV的增殖。此外,还检测了9个与免疫途径相关基因的表达水平的变化,q RT-PCR结果表明,与toll and IMD途径相关的基因表达水平没有显著变化,而与JAK/STAT途径相关的基因表达水平发生了显著变化,stat基因表达上调,socs6和socs2基因表达下调;两个抗凋亡基因,Bm NPV抑制凋亡蛋白1(iap1)和家蚕Bmiap2,其表达水平与对照组相比显著降低。推测抑制Hsp90蛋白活性后可能会影响家蚕细胞内JAK/STAT信号通路中关键基因以及抗凋亡相关基因的表达,进而影响Bm NPV的增殖。3.RNA干扰敲降Hsp90基因对Bm NPV增殖的影响采用RNA干扰技术在家蚕细胞内敲降Hsp90基因。q RT-PCR分析si RNA干扰后Hsp90的转录水平,结果发现经si RNA干扰后,Hsp90基因表达量显著低于对照组,表明敲降成功。进一步,比较分析了实验组和对照组中病毒基因组的拷贝数,结果表明,对照组的病毒基因组拷贝数显著高于实验组,说明敲降Hsp90可显著抑制Bm NPV的增殖。4.过表达Hsp90对Bm NPV增殖的影响以家蚕c DNA为模板扩增Hsp90基因并克隆该基因,构建融合表达载体p Fast Bac1-e GFP-Bm Hsp90-3×Flag及对照载体p Fast Bac1-e GFP-3×Flag,将重组载体分别转化Bm DH10Bac感受态细胞,转染Bm N细胞后获得重组杆状病毒,接种家蚕使Hsp90在家蚕体内过表达。q RT-PCR检测结果表明过表达组中Hsp90的相对表达量显著高于对照组,说明Hsp90在家蚕体内过表达成功;Western Blot检测结果进一步表明Hsp90蛋白在家蚕中成功表达。随后,采用TCID50法进一步检测Hsp90过表达后Bm NPV的复制水平。结果表明,过表达组的TCID50值显著高于对照组。采用q RT-PCR检测病毒基因组DNA拷贝数的变化,发现当Hsp90基因过表达时,病毒基因组DNA含量在感染24h时显著高于对照组,说明过表达Hsp90能够促进Bm NPV的复制,尤其是在感染早期。此外,研究还发现,过表达Hsp90后,Bm NPV抑制凋亡蛋白1(iap1)和家蚕Bmiap2的表达水平显著高于对照组,该结果与GA处理组相反,表明Hsp90活性的丧失可能导致Bm IAP和Bm NPV-IAP的降解,从而促进感染细胞的凋亡,抑制Bm NPV的增殖。5.抑制Hsp90蛋白活性对Bm NPV感染相关宿主蛋白的影响采用定量蛋白质组学分析法鉴定Hsp90在家蚕-Bm NPV互作中的作用。定量蛋白质组基于倍数变化大于1.3且P值小于0.05的筛选标准,共鉴定到了195个差异表达蛋白,其中上调表达蛋白136个,下调蛋白59个。KEGG通路分析表明,差异表达蛋白参与了长寿调节通路、m TOR信号通路、Fox O信号通路及Toll and IMD信号通路等关键通路。抑制Hsp90后,Bm NPV感染细胞中载脂蛋白III(Apo Lp III)及家蚕胰岛素相关结合蛋白(Bm IBP)的表达水平升高,11个锌指蛋白在GA处理的Bm NPV感染细胞中上调,推测抑制Hsp90活性可能直接或间接诱导锌指蛋白的表达。聚ADP核糖聚合酶(PARP)和X射线修复交叉互补蛋白6(XRCC6)的表达水平升高,表明抑制Hsp90可以触发DNA损伤修复途径。此外,还研究发现,4个与长寿调节途径相关的小热休克蛋白上调表达;免疫相关蛋白、细胞DNA修复相关蛋白等表达水平均显著提高。而11种蛋白激酶表达水平显著下降。研究结果表明,抑制Hsp90活性可导致Bm N细胞中蛋白质表达谱发生显著变化。综上所述,家蚕Hsp90蛋白在促进Bm NPV感染家蚕的过程中发挥了重要作用。研究结果有助于解析Hsp90在Bm NPV感染中的作用机制,可为阐明家蚕与病毒相互作用的分子机制提供新的线索。