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目的:建立检测抑癌基因p53凋亡刺激蛋白ASPP1和ASPP2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,并应用该方法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织和外周血液ASPP1、ASPP2 mRNA表达情况,从中进一步了解在NSCLC发生发展及诊断治疗过程中两基因表达量的变化,研究两基因的表达与NSCLC治疗方法敏感性的关系。方法:1、根据已知序列设计特异性引物,合成引物后进行反应性确认。2、分别制作ASPP1、ASPP2和β-Actin标准品。体外构建高浓度ASPP1质粒DNA作为实验用标准品;培养HL-60细胞,提取纯化高浓度的RNA作为ASPP2和β-Actin的标准品。3、收集、分离对照组和患者组血液标本单个核细胞,提取单个核细胞标本的total RNA,同时收集患者手术后病理证实为NSCLC的肿瘤组织,提取组织total RNA。检测所提取RNA的含量、纯度以及完整性。4、应用实时荧光定量RT-PCR的方法检测两目的基因和管家基因β-Actin mRNA表达水平,计算校正值及相对值进行统计分析结果。5、监测患者血液ASPP1和ASPP2的表达情况,观察治疗效果,并且探讨两抑癌基因表达水平与治疗的关系,用以评价放化疗敏感性。结果:1、实验证实设计的引物特异性较好,在适当的反应条件下未出现非特异性反应。2、体外构建的ASPP1质粒DNA标准品和培养HL-60提取的total RNA标准品经重复实验,均得到较好的扩增曲线和标准曲线,并且融解曲线峰型单一,具有良好的稳定性与重复性。3、所提取待测标本total RNA含量及纯度均较高,且具有良好的完整性。4、NSCLC患者肺组织标本与相应血液标本ASPP1、ASPP2相对值比较均具有显著性差异(P均﹤0.05);患者血液与对照组血液两基因表达也具有显著性差异(P均﹤0.05)。5、ASPP1和ASPP2表达量与肿瘤标志物细胞角质素片断抗原(CYFRA21-1,简称C21-1)和癌胚抗原(CEA)相关性分析,P均<0.05,表明肿瘤发生发展期间,ASPP mRNA与肿瘤标志物有相关性。6、不同患者在治疗过程中ASPP1和ASPP2 mRNA表达对化疗药物敏感性亦是不同。结论:标准品构建成功,可应用于定量检测。应用实时荧光定量RT-PCR的方法检测目的基因ASPP1和ASPP2的敏感性和特异性均较高,稳定性好。结果分析显示ASPP1、ASPP2在肺组织和相应血液中mRNA表达不同,具有组织分布不同的特点。患者血液与对照组比较,NSCLC发生时两基因的表达均下降,血液中ASPP1和ASPP2 mRNA的表达水平可以反映NSCLC疾病的状况,ASPP家族的表达与肿瘤的发生发展密切相关。在NSCLC患者治疗过程中,两种抑癌基因表达与化疗药物的敏感性相关。初步分析发现,应用化疗药物后,ASPP1和ASPP2表达升高的患者治疗效果更佳,说明该类型肺癌患者对所应用的化疗药物更敏感。这对分子水平继续研究肿瘤的治疗具有重大意义,此研究将会在NSCLC的治疗起到指导作用,在肺癌治疗敏感性上具有突出意义。