论文部分内容阅读
牛支原体是感染牛的重要致病性病原体之一,可引起包括牛肺炎、乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎在内的多种疾病,且在牛场中较难被彻底消灭。我国自2008年首次报道牛支原体肺炎至今,该病原已然成为危害我国养牛业的重要因素。目前国内外关于牛支原体的研究主要集中在病原的免疫及核酸鉴别诊断方面,关于牛支原体蛋白的免疫原性及免疫保护性特征的研究报道较少。本研究利用双向电泳(2-DE)技术,完成了牛支原体单个蛋白的分离并结合免疫印迹技术对其免疫相关蛋白进行了筛选,在本实验室2010年完成牛支原体湖北株的全基因组序列的测定和注释的基础上,筛选出了LPDH LPDH是一种黄素氧化还原酶,广泛存在于各种生物中,并在能量代谢过程中起重要作用。目前,人们已经鉴定了多种生物的LPDH基因,但是还没有与牛支原体LPDH相关的报道。本研究利用原核表达系统得到了大小约为68KDa牛支原体LPDH的重组蛋白,并通过条件优化将原本沉淀表达的蛋白呈现出部分上清表达,从而获取了最大程度类似于天然蛋白的重组蛋白,纯化后的重组蛋白用M. bovis湖北分离株攻毒牛后获得的阳性血清进行Western blot分析,结果为阴性,但是Dot blot分析,结果为阳性,初步表明该重组蛋白具有免疫原性,再利用间接ELISA方法对重组蛋白进行免疫学交叉反应实验,发现LPDH重组蛋白与人工感染和自然获得感染所得的M. bovis阳性血清均能发生特异性反应,进一步证明LPDH重组蛋白可以作为建立诊断方法的候选抗原。利用该重组蛋白制备抗牛支原体LPDH的多克隆抗体并对所得抗体进行纯化。我们对牛支原体不同细胞组分进行提取,并最终利用抗LPDH的抗体通过Western blot实验证明：在细胞不同蛋白组分提取物中都存在一个大小约为63Kda的蛋白,而这一结果表明牛支原体LPDH同时存在于支原体的胞膜与胞浆两个蛋白组分组分中。目前虽然关于关于牛支原体致病机制仍不是十分清楚,但是大多数学者都认为支原体的致病一个必不可少的过程是支原体对宿主上皮细胞的粘附过程,牛支原体菌体表面可能存在与致病相关的脂质相关膜蛋白(LAMPs),本研究利用激光共聚焦(confocal laser scanning microscopy)技术可清晰的观查到重组蛋白粘附在牛呼吸道上皮(EBL)细胞表面,初步判断LPDH与牛支原体的粘附细胞过程相关。综合本研究中所有试验,我们判定牛支原体表面的确存在着LPDH,该酶具有免疫原性；体外表达该蛋白,发现其Western blot分析,结果为阴性,但是Dot blot分析,结果为阳性；ELISA实验结果显示该酶可以作为建立诊断方法的候选抗原；利用激光共聚焦技术,可观察到该酶在牛支原体粘附宿主细胞的过程中确实起一定作用。这些结论为进一步研究牛支原体粘附机制,致病力以及疫苗研制开辟了新的道路。