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DNA在紫外线诱导下会产生损伤,这种损伤会导致生物体生长迟缓、诱发突变甚至死亡。DNA光修复酶(photolyase,EC 4.1.99.3)可以吸收300-500nm的光子的能量来修复这种损伤。大肠杆菌photolyase含有两个辅基,分别为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和次甲基四氢叶酸(MTHF)。FAD为活性催化所必需,其生理状态是还原态(FADH-)的。MTHF则具有吸收传递能量的作用。 本文研究了DNA光修复酶(photolyase)的纯化、发酵和活性检测,并对其细胞和鼠体活性进行了初步研究。 第一章 photolyase的表达和纯化 E.coli phr基因构建到表达质粒pET-22b(+)中,获得pET-22b(+)∷phr(N+X),该质粒表达的目的蛋白为C末端偶联有6×His-tag的融合蛋白。BL21(DE3)/pET-22b(+)∷phr(N+X)经IPTG诱导表达,可表达近20%菌体总蛋白量的目的蛋白,其中约1/3为可溶性蛋白。利用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow一步亲和层析进行纯化,可以获得近95%电泳纯的photolyase。UV-Vis扫描和荧光扫描结果表明E.coli photolyase具有两个辅基,为MTHF和FADH。 第二章 BL21(DE3)/pET22b(+)∷phr的补料发酵 在10L BioFloⅣ发酵罐中利用补料分批培养技术发酵表达含重组质粒pET-22b(+)∷phr(N+X)的BL21(DE3)大肠杆菌,批量生产photolyase。在发酵过程中,尽量控制充足的溶氧量,温度37℃,在基础培养基内生长12h后,加终浓度1mmol/L IPTG于30℃诱导表达目的蛋白,4h后补加以甘油为碳源的补料,继续培养6小时,收集菌体。22h小时发酵结束后,菌体密度最终达40g/L,纯化所得蛋白约占总菌液的42mg/L。 第三章 cis-syn thymine-thymine CPD oligonucleotide的制备及利用反相高效液