猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起哺乳仔猪以呕吐、水样腹泻、脱水为主要症状的病毒性传染病。该病流行范围广,传播速度快,许多国家和地区受到严重的威胁。对PED的预防主要以疫苗免疫为主。PEDV适应细胞难度大,繁殖滴度低,培养条件复杂,是目前对该病毒研究所面临的主要困难,在一定程度上制约PEDV分子生物学的研究发展,严重阻碍PED疫苗的研究。因此,针对我国流行毒株遗传变异特性,分离培养并获得稳定适应细胞的PEDV毒株,对促进该病毒的基础性研究和相关生物产品发展具有重要的理论与实践意义。为了获得PEDV的大量繁殖,提高病毒滴度,本研究采用仔猪小肠传代细胞IEC、仔猪肾脏原代细胞和仔猪小肠组织分离培养PEDV,通过病毒形态学、分子生物学、免疫学及动物回归试验等传统方法进行鉴定,分离获得一株猪流行性腹泻病毒PEDV NJ株,为PEDV的分离培养提供新的思路和方法。本研究为PED的流行病学、实验室诊断和病毒的生物学特性的进一步研究奠定了重要的物质基础。PEDVNJ的分离培养与鉴定。本研究将RT-PCR检测PEDV阳性的病料经过处理后,接种IEC细胞、仔猪肾脏原代细胞和仔猪小肠组织,并进行连续体外培养,命名为NJ株。目前IEC细胞培养毒已盲传至第45代,猪肾原代细胞培养毒盲传至第28代,仔猪小肠组织培养毒盲传至第3代,感染细胞均已经产生规律性病变。套式RT-PCR检测以上三种培养毒,均得到与预期片段理论值相符的目的条带。通过普通电镜和免疫电镜观察,确定该病毒具有典型的纤突状结构,是具有囊膜的冠状病毒,直径大小约100～160nm；超薄切片电镜观察,病毒大小为60-80nm,部分呈中空状,多呈致密核芯,病毒粒子聚集在细胞浆内。间接免疫荧光检测IEC细胞、猪肾原代细胞和仔猪小肠组织病毒培养物均出现明显荧光。间接ELISA检测第30、40代IEC细胞培养毒和第10、20代猪肾原代细胞培养毒繁毒情况,病毒产量均呈上升趋势,且猪肾原代细胞培养毒产量增长较为明显。跟踪检测IEC细胞培养毒的TCID50,病毒滴度随传代次数增加整体呈上升趋势,至第45代,TCID50为10-45/0.1mL。动物回归试验结果显示,仔猪于攻毒后20h出现轻微腹泻,第4d出现水样腹泻,并于第6d死亡。剖检发现肠管明显扩张,内充满黄色液体,肠壁变薄,肠系膜呈索状充血。用RT-nested-PCR检测收集的粪便及小肠样品,外套PCR在攻毒后4-6d粪便样品中扩增出目的条带,内套PCR检测粪便及小肠均出现与预期结果相符目的条带,测序结果与灌服前细胞培养毒基因序列一致,未发生基因突变；间接免疫荧光检测攻毒仔猪小肠组织病料可见明显荧光,以上结果说明该仔猪感染PEDV NJ。PEDV NJ主要基因序列的分析。本试验对PEDV NJ亲本株的结构基因以及ORF3进行测序。结果显示,NJ株与近年来中国部分地区PEDV流行毒株的亲缘关系较近,与传统毒株及疫苗株亲缘关系较远。本研究扩增第33代IEC细胞培养毒的M基因全序列,通过与NJ亲本株、国内外流行毒株及疫苗株基因比对发现,经过细胞传代的NJ株M基因序列变异较大,与亲本株分处两个不同分支,而与韩国弱毒株DR13(Attenuated)和日本弱毒株83P-5(100th)亲缘关系较近,同处于一个亚群。本研究还对IEC细胞培养毒第5、10、15、25代M部分基因进行扩增,跟踪检测发现该基因片段较为保守,盲传至第5代出现碱基突变,盲传至15代时突变碱基数有所增多,盲传至25代时增多的突变位点又随之消失。猪流行性腹泻病毒PEDV NJ株的成功分离,为PEDV分离毒基础生物学特性及病毒相关应用研究奠定了重要的物质基础。