杨树木质素合成基因C3H与HCT表达下调对细胞壁组成与结构的影响

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传统的化石能源由于不可再生,破坏生态并且污染环境,用途必然受限,因此未来对可再生能源的需求将日益迫切。用生物乙醇这样的生物燃料替代石化燃料(石油、天然气、煤)将减少相关行业对石化燃料的依赖,并且避免了由此而来的所有环境问题。杨树作为林业研究的模式植物,由于分布广、适应性强、速丰生产、易于无性繁殖且遗传背景清楚,而成为林木生物质能源研究的首选。  木质纤维素是地球上数量最大的可再生资源,由木质素、半纤维素及纤维素三者的紧密结合产生的抗降解屏障作用是纤维素作为能源利用的主要障碍,且细胞壁中的木质素是造成木材造纸污染和生产纤维乙醇成本高的一个主要因素。可以通过抑制木质素生物合成途径关键基因的表达,来降低木质素含量或改变木质素成分,从而提高木材纤维素转化效率并降低转化成本。  本论文选定莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶HCT基因和毛白杨香豆酰莽草酸/奎宁酸羟化酶C3H基因为调控目标,通过根癌农杆菌叶盘转化法转化银腺杨无性系84K,经过NPT-Ⅱ基因和目标基因片段的PCR鉴定后转基因植株移栽至温室,低温诱导后扦插繁殖,最终得到C3H1-RNAi有26个株系73个单株,HCT1-RNAi有9个株系26个单株。转基因植株和对照植株新萌枝条通过实时定量PCR检测目标基因转录表达量,C3H1-RNAi转基因株系中10、55、57的C3H1基因表达量较野生型植株平均下调了75%,HCT1-RNAi转基因株系中202、205、207的HCT基因比野生型植株的平均表达量下调了69%。通过表型观察发现,同一时期生长的转基因植株株高明显比野生型要矮,组培苗观察转基因植株根系比野生型发达,不定根增长,侧根数量明显增多。  C3H1-RNAi和HCT1-RNAi转基因植株和野生型84K植株茎横切面解剖结构观察比较发现,木质部中转基因植株的细胞壁相对野生型总体变薄,细胞腔相对较小,导管较多,导管分布杂乱;野生型细胞壁相对较厚,导管分布均一,转基因植株韧皮纤维细胞较野生型数量少。HCT1-RNAi转基因株系木射线相对野生型植株明显增加,反映出转基因植株木质部发育和木质素沉积方式发生了改变。此外,C3H1-RNAi和HCT1-RNAi转基因株系比野生型植株内中外三层木质部的平均导管腔茎、导管壁、木纤维腔径、木纤维壁均变小。壁腔比值都小于1,比较适合作为造纸纤维原料。在转基因杨树材性分析方面,本论文采用红外光谱,多维核磁共振技术(定量碳谱,二维技术和磷谱结合的方法),凝胶色谱(GPC)等方法对分离纯化的木质素做了如下研究:(1)采用磨木木质素(MWL)结合后续纤维素酶解木质素(CEL)梯度提取的方法从HCT-RNAi转基因植株和对照植株中选择性得到位于不同区域的木质素组分。研究发现,对于转基因和对照组,CEL相比MWL均具有较多的β-O-4连接结构和较高的S/G比。HCT基因调节的杨树木质素中可以观察到少量的H单元。此外,HCT-RNAi转基因杨树木质素中的对羟基苯甲酯(PB)含量有所增加。(2)采用纤维素酶弱酸解木质素方法(EMAL)从HCT1-RNAi与C3H1-RNAi转基因植株以及对照植株中得到了原本木质素,研究发现,C3H及HCT基因下调引使得HCT-EMAL和C3H-EMAL中的总甲氧基含量下降,而相应的S/G比例有所上升。同时,HCT-EMAL及C3H-EMAL中β-O-4连接的量相比于野生标准样品EMAL有所增加,但β-β和β-5连接含量有所降低,木质素中醚键的升高将有利于后续的脱木素处理。此外,HCT和C3H转基因杨树木质素(EMAL)中的对羟基苯甲酯(PB)含量有所增加。(3)为了更好地理解转基因前后的杨树木材中的半纤维素的变化,本论文从C3H1-RNAi转基因植株和野生型84K中分离提取得到了DMSO和碱溶性半纤维素。采取红外光谱,核磁共振技术(定量碳谱与二维核磁共振结合的方法),凝胶渗透色谱(GPC)等方法解析半纤维素化学成分和结构变化,发现C3H-RNAi转基因杨树的半纤维素的分子量比野生型要高,同时C3H-RNAi转基因材料的DMSO和碱溶性半纤维素分子量的分散系数更均一,说明了从转基因杨树中更有利于提取分子量更高且分散系数更均一的半纤维素组分。此外,相比碱性半纤维素提取方法,DMSO提取的半纤维素样品中除了4-甲氧基-葡萄糖醛酸-木聚糖,还具有其它杂聚糖;而碱提取的半纤维素主要是4-甲氧基-葡萄糖醛酸-木聚糖,还具有其它杂聚糖;而碱提取的半纤维素主要是4-甲氧基-葡萄糖醛酸-木聚糖。综上所述,通过转基因技术能够改变木质素的成分和结构,进而改善转基因杨木脱木素等化学加工性质,同时能够改善半纤维素的提取和分离,这将为林木材性改良,木质纤维素高效利用以及生物质能源型杨树的遗传育种研究奠定基础。
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