牛樟芝菌丝体活性成分Antrodin A对酒精性肝损伤的保护作用研究

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牛樟芝(Antrodia camphorata)作为台湾民间传统的解酒药用真菌,其子实体具有抗肿瘤、抗癌、抗炎等多种活性。虽然牛樟芝子实体具有如此多的功能,但生长极为缓慢,自然产量稀少,阻碍了进一步的研究。因此,近年来许多学者将牛樟芝菌丝体作为研究对象,发现其含有丰富的次级代谢产物,如泛醌类化合物、马来酸琥珀酸衍生物、三萜类化合物、多糖等。文献调研发现,牛樟芝菌丝体可显著抑制急性乙醇中毒大鼠血清中ALT、AST、AKP和胆红素的升高,对肝脏起到保护作用,但作用机制尚不明确。本论文以固态发酵牛樟芝菌丝体为研究对象,通过构建酒精干预L-O2细胞模型、急性酒精肝损伤小鼠模型,探究牛樟芝菌丝体内马来酸琥珀酸衍生物和泛醌类化合物的保肝活性及其作用机制。得到主要结论如下:(1)将固态发酵牛樟芝菌丝体乙酸乙酯相活性成分硅胶柱层析分离和HPLC分析,获得了四种活性物质Antroquinonol B(Aq B)、Antrodin C(Ad C)、Antrodin A(Ad A)和Antroquinonol(Aq),并对这四种活性成分进行抗酒精性肝细胞(LO-2)损伤活性初筛。模型组(AL)细胞收缩,变亮变圆,细胞贴壁能力弱,状态较差,活力降低。Aq B和Ad C组情况与AL组相似,细胞形态发生明显改变且贴壁性降低;Ad A组和Aq组仅有少部分细胞出现形态变化,细胞状态好于AL组。并且,Ad A和Aq能显著降低培养液中ALT和AST活力;Aq B和Ad C虽有降低的趋势,但与AL组相比并无显著性差异。同时,Ad A和Aq显著降低了细胞中MDA的含量并提升了SOD和GSH含量;综合分析,Ad A和Aq在抵抗酒精性肝细胞损伤,提高细胞抗氧化能力方面的效果优于Aq B和Ad C。(2)以活性成分Ad A和Aq为研究对象,通过小鼠急性酒精肝损伤模型,从肝组织病理学观察、血清中肝损伤标志酶活性、肝脏脂质过氧化和抗氧化酶活性等方面评价这两种活性物质的保肝效果。高剂量的Ad A(Ad AH,200 mg/kg)和Aq(Aq H,200 mg/kg)能降低小鼠肝指数,抑制血清中ALT、AST和AKP的升高,减少肝细胞炎症和脂质浸润。酒精摄入导致AL组小鼠的TG含量显著上升,阳性对照组(PC)显著降低了血清中TG的水平。治疗组(ELALEH、Ad AL、Ad AH、Aq L和Aq H)也起到了与PC组相近的治疗效果。AL组小鼠血清HDL-C水平与正常组(NC)相比显著降低。除Ad AL组外,ELAE、Ad A、Aq各剂量组及PC组均能显著增加小鼠血清HDL-C水平。通过RT-q PCR分析了小鼠肝脏中与氧化应激(CYP2e1、Nrf-2和HO-1),脂质过氧化(FAS)和炎症(TNF-α和TLR4)相关的基因的表达水平。与NC组相比,AL组CYP2e1,FAS,TLR4和TNF-α的m RNA表达水平显着升高,而Nrf-2和HO-1的m RNA表达水平显着下降。但是,这些变化被高剂量的Ad A逆转,Nrf-2,HO-1,FAS和TNF-α的m RNA表达均恢复到正常水平,CYP2e1和TLR4的m RNA表达也与PC组相似。(3)探究了牛樟芝样品对急性酒精肝损伤小鼠肠道菌群结构的影响。酒精摄入可降低小鼠肠道菌群的群落多样性,Shannon指数与Simpson指数表明,提前灌胃高剂量的EALE、Ad A和Aq H可预防群落多样性降低。在门水平上,AL组小鼠肠道厚壁菌门(33.38%)和拟杆菌门(31.51%)的群落丰度降低,变形杆菌门增加(16.56%);经高剂量的EALE、Ad A和Aq预防治疗,厚壁菌门(37.75%、36.02%和48.17%)群落丰度升高,变形杆菌门(11.53%、8.42%和10.22%)降低。主成分分析显示,AL组小鼠的肠道菌群与NC组相比产生差异。EALEH组、Ad AH组和NC组的样本点比较集中且聚集在一起,表明这三组小鼠的粪便菌群物种组成相似;Aq H组虽经预防治疗,但样本点与NC组和AL组仍有一定距离,与NC组间还存在着差异。小鼠肠道菌群组间差异显著性检验表明,补充Ad A可以缓解酒精引起的肠道菌群失调。环境因子关联分析显示Faecalibaculum、Lactobacillus和Coriobacteriaceae_uc-002菌群与ALT、AST、AKP和MDA呈显著负相关。
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