间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。在不同的诱导条件下,MSCs可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSCs的主要来源为成人骨髓,但成人骨髓源MSCs的细胞数量及增殖分化潜能会随着年龄的增大而下降,且病毒感染率较高,此外供者MSCs的采集需行骨髓穿刺术,因而MSCs的临床应用存在很大的局限。近年的研究表明,从胎盘中可分离出MSCs,它们和骨髓MSCs一样,在合适的培养条件下具有多向分化能力。MSCs作为骨髓造血微环境中的重要组成成分,它通过分泌多种造血生长因子以及细胞与细胞间的直接接触等方式作用于造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),因而在造血调控中发挥重要的作用。目前,MSCs已被用来体外支持HSCs扩增,体内联合HSCs移植促进造血重建。本研究在成功分离培养人胎盘源间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)的基础上,探讨人PMSCs在体内和体外支持造血的功能效应。本文分为两部分。第一部分阐述了人PMSCs的分离培养和鉴定,并探讨人PMSCs对脐血单个核细胞(MNCs)体外生长的支持作用。将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁和传代培养获得人PMSCs,运用流式细胞仪检测其表面标志,分别联合应用β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松体系和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松体系将其诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,继而采用碱性磷酸酶检测和vonkossa染色对其进行成骨分化鉴定,采用油红染色对其进行脂肪分化鉴定。将用密度梯度离心法分离的脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养,通过细胞计数和流式细胞仪分别检测造血细胞的生长情况。结果显示:1.从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs,贴壁细胞呈成纤维细胞状,经流式细胞仪检测其表型为CD29~+、CD44~+、CD105~+、CD106~+、CD166~+、CD34~-、CD45~-、HLA-DR~-;2.PMSCs经成骨诱导3周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,von kossa染色可见明显钙结节。PMSCs经成脂诱导2周后,油红染色呈阳性,有明显的脂滴出现;3.人PMSCs+脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45~+细胞数在各培养时间点均明显高于对照组,在培养第7天,CD45~+、CD14~+及CD19~+细胞数共培养组也明显高于对照组。结果表明,人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。第二部分利用同种异基因小鼠骨髓移植模型,比较经骨髓腔内注射(intra-bonemarrow injection,IBMI)和外周静脉输注(intravenous injection,Ⅳ)两种途径移植小鼠骨髓单个核细胞(BMNCs)后受体早期的造血重建情况,建立了小鼠IBMI技术平台,并利用IBMI技术初步探讨了人PMSCs联合脐血MNCs共移植入SCID鼠体内后的早期造血重建效应。以BALB/c小鼠为供体,通过IBMI和Ⅳ两种途径将其BMNCs移植入经致死量辐照预处理的C57BL/6受鼠体内。60只受鼠随机分为3组:骨髓腔内注射高剂量组1(IBM1组)、骨髓腔内注射低剂量组2(IBM2组)、尾静脉注射组(Ⅳ组),每组20只。在骨髓移植后1、3、6、9 d分别计数各组受鼠胫骨骨髓腔内细胞总数,并用流式细胞仪检测供体植入水平(供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞数)。以人PMSCs和脐血MNCs为供体,通过IBMI方法或结合Ⅳ方法,将两种细胞联合或单独移植入经亚致死量辐照预处理的SCID受鼠体内。9只受鼠随机分为3组:联合移植A组(PMSCs+脐血MNCs,IBMI)、单独移植B组(脐血MNCs,IBMI)、联合移植C组(PMSCs经IBMI,脐血MNCs经Ⅳ),每组3只。在移植后14 d取各组SCID小鼠注射侧和对侧胫骨腔内骨髓细胞,并用流式细胞仪检测分析人CD34~+、CD45~+细胞的植入水平。结果显示:1.IBM1组和IBM2组注射侧于移植后6 d胫骨骨髓腔内细胞总数、供体来源细胞总数、供体来源髓系细胞总数均明显高于Ⅳ组;2.SCID小鼠移植后14 d,B组注射侧及对侧胫骨骨髓腔内的人CD34~+、CD45~+细胞的百分比均明显低于A组小鼠的注射侧和对侧。结果表明,IBMI较Ⅳ更能促进同种异基因骨髓移植后的早期造血功能重建;人PMSCs可以增加脐血MNCs的植入,促进造血重建。综上所述,本实验从人胎盘组织中成功分离培养获得PMSCs,人PMSCs在体外对脐血MNCs的生长有明显的支持作用。通过IBMI技术将人PMSCs与脐血MNCs共移植于SCID小鼠体内,人PMSCs可有效促进脐血MNCs的早期造血重建。这为进一步研究人PMSCs体内和体外支持造血的相关分子机理奠定了实验基础。