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曲霉（Aspergillus）广泛存在于自然环境中,可通过孢子形式快速播散,从而导致多种慢性和急性曲霉病。近年来,侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis,IA）的发病率呈现上升趋势,其中以侵袭性肺曲霉病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）最为常见,病死率高达50%以上。引起侵袭性肺曲霉病感染的曲霉属中,以烟曲霉感染最为常见,占发病率的90%以上,其次为黄曲霉、黑曲霉等。尽管三唑类等抗真菌药物在侵袭性肺曲霉病的治疗中发挥了重要作用,但其病死率仍居高不下,且不断有三唑类抗真菌药物耐药烟曲霉感染而导致治疗失败的报道。ARTEMIS的一项多国家调查研究显示,烟曲霉对三唑类抗真菌药物耐药率为5.8%,类似的数据还有荷兰5.3%、丹麦5.5%等。而英国的三唑类抗药物耐药烟曲霉的检出率相对较高,2008年和2009年的耐药率分别为14%和20%。2015年荷兰再次多中心调查研究显示,三唑类抗真菌药物耐药烟曲霉菌株的检出率在5%～10%,但高危患者的耐药率高达30%。可见,三唑类耐药烟曲霉菌株检出率呈现上升趋势。三唑类抗真菌药物对曲霉的作用部位在细胞膜,通过抑制14α-去甲基酶而使得曲霉细胞膜中羊毛甾醇到麦角固醇的生物合成受阻,从而抑制曲霉生长。烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的编码基因Cyp51A出现点突变,如54、220等位点突变,可引起其对三唑类抗真菌药物的获得性耐药;烟曲霉上游启动子区域一定长度的串联重复序列（tandem repeat,TR）,如TR34/L98H突变,被认为是引起三唑类抗真菌药物耐药的天然耐药机制。然而,在ARTEMIS的一项多国家调查研究显示,1 1株伊曲康唑耐药烟曲霉菌株中,有3株烟曲霉并未检测到Cp51A基因突变。可见,烟曲霉Cyp51A基因突变并非其对三唑类抗真菌药物耐药的唯一产生机制。有研究发现,热休克蛋白90（Heat shock protein 90,Hsp90）对于真核生物的存活至关重要,在真菌耐药过程中有一定作用。Hsp90伴随着钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）形成了信号转导网络,该网络是形成和维持耐药性所必需的。Hsp90抑制剂或钙调神经磷酸酶抑制剂阻碍这些信号网络的形成,可防止耐药性的产生,降低烟曲霉菌株毒力;即使耐药性产生,也能将其消除。Hsp90抑制剂格尔德霉素最常用于抗肿瘤治疗,但由于其肝脏毒副作用而限制了其广泛使用。其衍生物 17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）具有更低的肝脏毒副作用和更强的抗肿瘤活性。然而17-AAG对三唑类耐药烟曲霉菌株的抗菌活性尚不明确。曲霉体外药物敏感性检测在各个医院并未常规开展,本地区尚缺乏烟曲霉临床分离株的体外药物敏感性相关数据。因而,本研究的主要目的是:1.收集本地区烟曲霉临床分离株,检测其对三唑类抗真菌药物的体外药物敏感性,筛选耐药烟曲霉菌株,并对其耐药机制初步探讨。2.通过体外、体内实验,检测17-AAG对三唑类耐药烟曲霉临床株的抗菌活性,明确17-AAG在三唑类耐药烟曲霉菌株应用中的价值。第一部分烟曲霉临床分离株三唑类药物耐药性筛查及其耐药机制初步探讨目的:检测烟曲霉临床分离株对三唑类抗真菌药物的体外敏感性,筛选耐药烟曲霉菌株,探索耐药烟曲霉菌株的Cyp51A基因突变情况。材料与方法:收集南京和常州5家大型三甲医院2012年8月～2015年7月的烟曲霉临床分离菌株。所有烟曲霉菌株均经菌落形态、显微镜下特征或分子生物学鉴定证实,10%甘油-80℃冰冻保存。依据欧洲抗菌药物委员会（EUCAST）微量稀释法检测烟曲霉菌株对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑的体外敏感性。回顾分析耐药烟曲霉菌株感染患者的临床资料。提取并扩增耐药烟曲霉菌株的Cyp51A基因,ABI 3730XL DNA 基因测序,所得序列同 GenBank AF.338659 烟曲霉Cyp51A基因标准序列比对以明确其突变情况。结果:共收集到126株烟曲霉临床分离菌株,并经鉴定证实。通过体外药物敏感性实验共检测到4株耐药烟曲霉菌株（3.17%）,最小抑菌浓度（MIC）均为16mg/L;其中1株烟曲霉菌株（0.8%）同时对伏立康唑和泊沙康唑耐药,最小抑菌浓度分别为4mg/L和0.5mg/L。4株三唑类耐药烟曲霉菌株中,2株Cyp51A基因存在TR34/L98H突变,1株具有M2201突变,1株未检测到Cyp51A基因突变。4例三唑类耐药烟曲霉菌株感染患者中,3例患者死亡,1患者生存,病死率高达75%。结论:本地区存在三唑类抗真菌药物耐药烟曲霉株,且伊曲康唑耐药率高于伏立康唑和泊沙康唑,但耐药烟曲霉临床分离株的检出率仍低于其他国家。烟曲霉Cyp51A基因突变并非其对三唑类抗真菌药物耐药的唯一机制。三唑类耐药烟曲霉临床分离株的出现为侵袭性肺曲霉病的治疗带来新的挑战。第二部分17-AAG对三唑类耐药烟曲霉临床株抗菌活性影响的研究目的:通过体外、体内实验,检测17-AAG对三唑类耐药烟曲霉临床株的抗菌活性,明确17-AAG在三唑类耐药烟曲霉菌株应用中的价值。材料与方法:采用EUCAST方法检测第一部分中4株三唑类耐药烟曲霉临床分离株对伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、17-AAG、环孢素A（CsA）和他克莫司（FK506）的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）或最低有效浓度（minimum effective concentration,MEC）。采用棋盘法检测伊曲康唑、伏立康唑或泊沙康唑与17-AAG、CsA或FK506的部分抑菌浓度（fractional inhibitory concentration,FIC）。构建三唑类耐药烟曲霉菌株感染的侵袭性肺曲霉病大鼠模型,分组予以伏立康唑、17-AAG和FK506单药或联合治疗,观察各组大鼠感染后第1天～第15天的生存情况;分别检测各组大鼠感染后第3天和第6天的血GM实验;3～10天死亡大鼠,右肺检测肺烟曲霉菌落负荷,左肺分析组织病理学情况。结果:4株三唑类耐药烟曲霉对伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑最小抑菌浓度范围分别为 16mg/L,0.5mg/L～2mg/L 和 0.25mg/L～2mg/L;对 17-AAG、CsA 和FK506的低有效浓度范围分别为8mg/L～32mg/L、8mg/L～32mg/L和0.125mg/L～0.5mg/L。除有1株烟曲霉在伊曲康唑联合CsA中表现为无关作用,其他联合的部分抑菌浓度均表现为协同或累加。D组（伏立康唑+17-AAG 20mg/kg）大鼠的存活时间长于A组（伏立康唑）（P=0.044）和E组（伏立康唑+17-AAG 60mg/kg）（P=0.011）,H 组（伏立康唑+FK506 30ng/kg）和 Ⅰ 组（伏立康唑+FK506 90ng/kg）的大鼠的存活时间相比A组（伏立康唑）无统计学差异（P=0.402 and P=0.267）。D 组（伏立康唑+17-AAG 20mg/kg）GM 值明显低于B 组（17-AAG 20mg/kg）和 C 组（17-AAG 60mg/kg）（P＜0.05）,但与 A 组（伏立康唑）比较无明显差异（P=0.431）。D组（伏立康唑+17-AAG 20mg/kg）大鼠菌落负荷明显低于A组（伏立康唑）（P=0.032）、B组（17-AAG 20mg/kg）（P=0.019）和C组（17-AAG 60mg/kg）（P=0.011）,其差异有统计学意义;相比E组（伏立康唑+17-AAG 60mg/kg）差异无统计学意义（P=0.109）。D组（伏立康唑+17-AAG 20mg/kg）和A组（伏立康唑）大鼠肺组织病理切片,肺泡完整,中性粒细胞浸润为主,见少到中等量烟曲霉孢子。H组（伏立康唑+FK506 30ng/kg）和J组（PBS）的鼠肺组织病理切片见肺泡结构消失,细支气管和血管周围水肿渗出严重,见大量烟曲霉孢子。结论:17-AAG、CsA和FK506对三唑类抗真菌药物耐药烟曲霉菌株体外具有良好的抑菌活性,抗真菌药物联合使用可增其强抗烟曲霉效果。小剂量17-AAG（20mg/kg）联合伏立康唑可显著延长IPA大鼠的生存时间、降低肺菌落负荷和血GM值。肺组织病理学与IPA大鼠肺部病变严重程度呈正相关性。小剂量17-AAG（20mg/kg）单药、大剂量17-AAG（60mg/kg）和FK506单药或联合伏立康唑均不能有效改善IPA大鼠的生存时间。尽管17-AAG为三唑类耐药烟曲霉的治疗提供了新的思路,但其安全性和有效性仍需进一步探讨