凡纳滨对虾育苗系统细菌资源挖掘及溶藻弧菌基因组初步分析

来源 :广东海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yulei000111
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本研究从华南沿海地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗系统采集水样和幼体,通过高通量测序对育苗水体菌群结构进行分析;从水体和幼体分离鉴定细菌,筛选潜在有益菌;对弧菌耐药性进行检测与评价;对7株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)进行了全基因组测序和基本信息分析,为对虾育苗系统细菌资源挖掘和弧菌病害防控提供了基础。首先,采用Illumina高通量测序对9个对虾育苗场(广东:DH、GL、HD、HY、RH;广西:HT、ZK、ZZ;海南:HC)共42个苗池水体菌群结构进行了分析。结果显示,育苗场地理位置、幼体期和幼体健康状态对水体菌群结构都具有明显影响。除GL苗场仔虾5期组外,其他组苗池水体菌群均以拟杆菌门(Bacteroidetes)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria)为最优势或次优势菌群。科水平上,以红杆菌科(Rhodobacteraceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、束缚杆菌科(Haliscomenobacteraceae)和微杆菌科(Microbacteriaceae)为优势,其中红杆菌科以绝对优势存在于所有苗池,相对丰度为22%-49%。优势属水平上,海命菌属(Marivita)、褐杆菌属(Phaeobacter)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、栖东海菌属(Donghicola)、棕指藻杆菌属(Phaeodactylibacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)和Epibacterium普遍或较普遍存在于正常苗池,可作为健康苗池的候选指示菌群,而弧菌属(Vibrio)则可作为发病苗池指示菌。接着,从育苗水体和幼体分离细菌并通过16S r RNA基因测序初步鉴定,结合胞外酶和拮抗荧光弧菌活性等特征筛选非弧菌类的潜在益生菌。本研究共分离保存了231株非弧菌属细菌。变形菌门(Proteobacteria)最为常见(94株),其中假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)菌株最多;其次为厚壁菌门(Firmicutes)(67株),且大多数分离物属于芽孢杆菌属(Bacillus),而拟杆菌门分离菌(46株)均属于黄杆菌科,且南海海杆菌属(Meridianimaribacter)菌株最多;而24株放线菌分离物中,一半为微杆菌属(Microbacterium)。筛选到2株均能抑制荧光弧菌且属于水体优势菌群的潜在益生菌,即Pseudoalteromonas sp.HD-L11和Epibacterium sp.CX-W13,其中,HD-L11还具有较强蛋白酶和淀粉酶活性。进一步,结合16S r RNA和HSP60基因测序对46株弧菌进行鉴定,并通过纸片扩散法测试其对17种药物敏感性。结果表明溶藻弧菌是育苗水体最优势弧菌;耐药性分析显示:46株弧菌对呋喃唑酮、头孢克肟、氨苄青霉素和阿莫西林的耐药率都达50%以上,对红霉素、环丙沙星耐药率较低(<5%),而对氯霉素均无抗药性;63%弧菌耐受≥4种抗生素,15%菌株耐受≥7种抗生素。最后,利用三代Pac Bio测序技术,对7株溶藻弧菌进行全基因组测序、注释和共线性分析。结果显示7株菌均有ch1与ch2两个环状染色体,其中3株溶弧菌有1-2个质粒。大小约5.20-5.33 Mb,GC含量为44.61%-44.74%。基因组编码蛋白功能注释获得CDS为4531-4768个;其中3030-3069个CDS获得COG功能注释,2643-2675个获得KEGG注释,2740-2799个获得GO注释,4474-4711个获得Refseq注释,3937-4029个获得Pfam注释,1517-1541获得TIGRFAMs注释。其中COG功能注释显示已知的基因中,氨基酸转运和代谢基因比列最多,其次是转录相关的蛋白基因。共线性分析显示,7株溶藻弧菌主要分为两大类,菌株间存在较频繁的同源片段倒位与缺失现象。
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