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研究目的急性髓系白血病(AML)是一种异质性血液癌症,目前主要的治疗方法是化疗和骨髓干细胞移植,但化疗的特异性和配型的成功率均较低,因而患者的治愈率并不高。基于此,已有对于AML治疗的新型小分子靶向药物和免疫靶向药物的研究,可通过靶向AML细胞提高患者的治愈率和整体生存率。近年来,靶向药物研究中的抗体治疗已得到社会认可,并且已有多种抗体药物上市,且关于AML治疗的抗体药物如CD33单抗药物已上市。此外,关于AML细胞表面其它靶点的研究也正在进行。研究表明,CD44在AML细胞表面高表达,且参与AML干细胞的发生和发展,并已有靶向AML细胞表面分子CD44的治疗性抗体的研究。但是,传统单克隆抗体制备过程繁琐,且人源化过程复杂,故难以将理论研究转化到实际应用。因此,本课题选择CD44作为靶标,并筛选易人源化的纳米抗体,为进一步研制新一代治疗AML的靶向性药物奠定基础。研究方法1.CD44胞外结构域抗原的制备:构建CD44原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过包涵体复性的方式制备抗原,并进行SDS-PAGE和ELISA分析。2.抗CD44纳米抗体的噬菌体文库构建:将表达的CD44抗原对健康双峰驼进行免疫,通过细胞分离,总RNA提取以及PCR等方法将编码纳米抗体的核酸序列连接到噬菌体载体上,构建抗CD44纳米抗体的噬菌体文库。3.抗CD44纳米抗体的筛选:利用噬菌体展示纳米抗体和固相抗原的结合,通过数轮的“结合-洗脱-结合”后富集特异性结合的噬菌体,之后进行菌液ELISA和序列分析,从而获得抗CD44的纳米抗体。4.抗CD44纳米抗体的表达纯化以及特异性和活性的初步研究:构建抗CD44纳米抗体的表达载体,转化到大肠杆菌WK6菌株中,经过镍亲和层析和分子筛进行纯化;通过ELISA方法对抗CD44纳米抗体的特异性和活性进行初步鉴定。研究结果1.CD44胞外结构域抗原的制备:采用包涵体复性的方法获得了纯度大于95%的CD44抗原;通过ELISA分析显示CD44不带有任何标签并且复性成功,可作为抗原。2.抗CD44纳米抗体的噬菌体文库构建:免疫后,骆驼的血清抗体滴度达到了1:10000;最终构建的纳米抗体的噬菌体库容为2.5×10~8 CFU,菌落PCR表明纳米抗体基因插入正确率约为88%。3.抗CD44纳米抗体的筛选:通过序列分析,共获得了4株抗CD44的纳米抗体。4.抗CD44纳米抗体的表达纯化以及特异性和活性的初步研究:4株纳米抗体在WK6菌株中进行表达,通过镍亲和层析和分子筛纯化获得的纳米抗体的纯度大于95%;此外,ELISA结果表明,4株纳米抗体具有抗原特异性,且和传统抗体相比,4株纳米抗体的热稳定性更高。研究结论成功构建了抗CD44纳米抗体的噬菌体文库;筛选获得4株特异性的抗CD44纳米抗体;4株纳米抗体具有更高的热稳定性。因此,这4株纳米抗体可进一步用于靶向AML细胞的研究并且具有作为新的靶向性治疗药物的潜能。