目的:BPD是早产儿严重的肺部并发症,早产儿的体重、胎龄越低,发病率越高。BPD不仅是超低出生体重早产儿早期死亡的主要原因,也是1岁以内频繁再入院的主要原因,更是生长不足及远期神经系统发育不良的独立危险因素,严重影响新生儿今后的生活质量。因此,探索其发病机制,寻求有效的预防措施和治疗手段,成为目前亟待解决的问题之一。AECⅡ是肺泡上皮细胞的干细胞,是肺损伤时最易受损的细胞,受损后其增殖分化过程均出现障碍,是肺发育过程中肺泡化障碍的重要因素。AECⅡ的异常转分化,即上皮-间质转化是肺泡化障碍的重要机制之一,研究AECⅡ上皮-间质转化的机制,如何能够抑制或逆转上皮间质转化,具有重要意义。BMP7是转化生长因子-β超家族成员之一,具有广泛的生物学功能,可调节多种细胞的分化、增殖和凋亡。研究显示BMP7可抑制和逆转上皮细胞转分化为间充质细胞。近年来发现BMP7在肺组织的病理生理过程中发挥了重要的调节作用。本人的前期研究发现BMP7在BPD新生鼠肺组织中存在差异表达。为了证实BPD中AECⅡ是否也存在BMP7的表达异常,异常表达的BMP7是否活化了下游的信号转导蛋白smad,我们对新生鼠BPD模型组和对照组肺组织原代提取的AECⅡ进行BMP7及其信号转导蛋白smad1,smad2/3的检测;为了证实BMP7可能通过调控smad2/3蛋白磷酸化调节肺泡上皮细胞EMT参与到BPD的发生、发展,我们应用美国ATCC公司的大鼠肺上皮细胞RLE-6TN细胞系,通过外源性BMP7进行干预,观察细胞生物学功能、转分化指标及BMP7下游的转导蛋白smad1,smad2/3的变化;为了能够更好地调节BMP7表达以避免或减少EMT的发生,结合本课题组前期通过基因芯片技术对BPD模型大鼠标本进行micoRNA筛选,我们筛选出差异表达的micoRNA,通过生物信息学预测差异miRNA能否靶向结合BMP7,并通过扩大样本量验证差异表达miRNA,过;在证实BMP7在BPD中表达丰度逐渐减低,miR-365-3p在BPD中表达丰度逐渐增高的基础上,应用大鼠肺泡上皮细胞系,利用双荧光素酶报告基因证明二者之间的结合关系,利用基因转染技术,观察EMT相关标志物、BMP7和下游信号转导蛋白smad的变化,明确miR-365-3p靶向下调BMP7表达调控上皮-间质转化的过程。为miR-365-3p作为未来BPD治疗的特定靶标提供证据。研究方法:按照我们课题组以往的方法建立新生鼠BPD模型。将自然分娩的200只新生SD大鼠随机分到BPD组和对照组。BPD组新生鼠吸入80%的氧气,对照组新生鼠吸入空气,于实验后的3、7、14天,分别随机选取10只新生大鼠分离肺组织。行HE染色观察肺组织形态学,按照我们课题组以往的方法进行原代AECⅡ的提取、纯化培养和鉴定。纯化的AECⅡ细胞应用细胞免疫荧光定位BMP7、smad1、smad2/3蛋白的表达,Western blot测定AECⅡ细胞中BMP7、smad2/3、p-smad2/3蛋白的表达,qRT-PCR测定AECⅡ细胞中BMP7、smad1、smad2、smad3 mRNA的表达。从液氮中取出冻存的RLE-6TN细胞进行复苏、培养和传代,将生长良好的细胞进行消化,接种于6孔板中,细胞按照不同的处理因素分为4组:control组:正常RLE-6TN单层细胞。BMP7组:用10ng/ml的BMP7作用RLE-6TN单层细胞。EGF组:用20ng/ml的EGF作用RLE-6TN单层细胞。BMP7+EGF组:分别加入10ng/ml的BMP7和20ng/ml的EGF共同作用RLE-6TN单层。48小时收集细胞。于光镜下观察细胞形态学变化,细胞划痕实验观察细胞水平迁移情况,免疫荧光双染定位RLE-6TN细胞中E-cad/N-cad、Spb/vimentin的蛋白表达,免疫细胞化学染色定位RLE-6TN细胞中信号转导蛋白smad1、smad2/3的蛋白表达,Western blot测定RLE-6TN细胞中E-cad、N-cad、vimentin、smad1、p-smad1、smad2/3、p-smad2/3蛋白的表达,qRT-PCR测定RLE-6TN细胞中E-cad、N-cad、vimentin、smad1、smad2、smad3 mRNA的表达。通过TargetScan生物学信息预测网站,结合课题组前期采用基因芯片检测获得的结果,筛选出差异表达的micoRNA。行miRNAs qRT-PCR测定BPD肺组织和AECⅡ中miR-365-3p的表达。RLE-6TN细胞转染过表达miR-365-3p,行miRNAs qRT-PCR检测转染效率。于光镜下观察转染miR-365-3p mimics后RLE-6NT细胞的形态学观察变化。Western blot测定转染miR365-3p mimics后间质标志物N-cad和上皮标志物E-cad蛋白表达。qRT-PCR测定转染miR365-3p mimics后间质标志物N-cad和上皮标志物E-cad mRNA的表达。Western blot测定转染miR365-3p mimics后BMP7、smad2/3、p-smad2/3蛋白表达变化。qRT-PCR测定转染miR365-3p mimics后BMP7、smad2、smad3 mRNA表达变化。应用双荧光素酶报告基因验证miR-365-3p与BMP7的结合。结果:1、肺组织形态学观察可见随时间延长,BPD组肺泡数量减少,次级分隔减少,RAC值降低,提示出现肺泡发育停滞。免疫荧光结果显示BPD组BMP7表达明显高于对照组,细胞胞浆和胞核均可见。随日龄增加BMP7荧光强度逐渐减弱,14dBPD组胞核中基本看不到BMP7红色荧光。对照组基本恒定表达BMP7,并且表达主要定位于胞浆。Western blot显示实验第3天和第7天,BPD组BMP7蛋白表达较对照组增高,随日龄增加BPD组BMP7蛋白表达逐渐减低趋势。qRT-PCR显示BPD组中BMP7 mRNA表达较对照组明显增高,但呈现随日龄增加BMP7 mRNA表达逐渐减低趋势。2、免疫荧光结果显示smad1绿色荧光主要定位在细胞胞浆,胞核未见绿色荧光表达。smad2/3表达BPD组高于对照组,绿色荧光主要定位在细胞胞浆和胞核。7天BPD组smad2/3增高最明显,并且绿色荧光均定位在细胞胞核,胞质中仅有少量绿色荧光。14天BPD组smad2/3表达下降,绿色荧光主要集中在胞浆。略低于对照组的荧光强度。BPD组组间smad2/3的表达经历了在胞核表达先增多后减少的过程。Western blot显示BPD组组间呈现随日龄增加p-smad2/3蛋白表达明显增高然后减低趋势。smad2/3总蛋白表达逐渐减低趋势。qRT-PCR显示BPD组smad1mRNA表达呈现先减低后增高的变化,BPD组中smad2 mRNA表达较对照组明显增高,BPD组组间呈现随日龄增加smad2 mRNA表达逐渐增加趋势,smad3 mRNA的变化趋势同smad2。3、倒置相差显微镜下可见BMP7组细胞仍维持上皮样形态,细胞与细胞之间连接较紧密。EGF组细胞之间连接松散,间隙变大并有明显的丝状伪足形成,呈现出成纤维细胞样。而BMP7+EGF组细胞间细胞连接较EGF组紧密,丝状伪足减少。BMP7组不影响细胞的迁移能力,EGF组可导致细胞迁移能力增加,BMP7+EGF组细胞的迁移能力减低,一定程度抑制了细胞的迁移。免疫荧光双染定位可见EGF组E-cad表达较弱,N-cad表达较强;BMP7+EGF组E-cad明显增多,N-cad明显减少。EGF组Spb表达较弱,Vimentin表达较强;BMP7+EGF组Spb明显增多,Vimentin明显减少。Western blot显示control组和BMP7组N-cad和Vimentin均较EGF组表达量低,BMP7+EGF组较EGF组表达量低,但高于control组和BMP7组。control组和BMP7组E-cad表达量较EGF组增高,BMP7+EGF组较EGF组表达量高,但低于control组和BMP7组。qRT-PCR显示control组和BMP7组N-cad和Vimentin mRNA均较EGF组表达量低,BMP7+EGF组较EGF组表达量低。control组和BMP7组E-cad表达量较EGF组增高,BMP7+EGF组较EGF组表达量高,但低于control组和BMP7组。4、免疫细胞化学染色显示control组少量表达smad1蛋白,BMP7组、EGF组和BMP7+EGF组均未使smad1蛋白表达有明显增高,且定位主要在细胞胞浆,胞核仅见量少smad1表达。免疫细胞化学染色显示BMP7组和BMP7+EGF组均可见大量的smad2/3蛋白定位于细胞核,细胞核与细胞质均可见染成棕黄色的颗粒。control组和EGF组少量表达smad2/3蛋白,且smad2/3蛋白主要表达于细胞胞浆。Western blot显示BMP7组、EGF组和BMP7+EGF组smad1总蛋白的表达较control组均有不同程度下降。和control组相比,p-smad1蛋白在BMP7组表达略有升高,在EGF组和BMP7+EGF组的表达均有不同程度下降。smad2/3总蛋白在control组和BMP7组的表达基本一致,在EGF组的表达较control组明显下降,在BMP7+EGF组表达较EGF组有所升高。p-smad2/3蛋白在BMP7组表达明显升高,EGF组和BMP7+EGF组较control组均有不同程度增高,BMP7+EGF组增高的更明显。qRT-PCR显示各处理组smad1 mRNA表达较control组均有所减少。和control组比较,BMP7组smad2 mRNA的表达明显增高。EGF组smad2 mRNA的表达与control组无差异,BMP7组smad2 mRNA的表达和EGF组比较明显增高。BMP7+EGF组的smad2 mRNA的表达较control组增多,但较BMP7组减低。smad3 mRNA的表达变化趋势与smad2 mRNA基本一致。5、通过TargetScan生物学信息预测网站,结合课题组前期采用基因芯片检测获得的结果,筛选出24个差异表达的micoRNA,其中miR-365-3p与BMP7可能存在靶向结合位点。miRNAs qRT-PCR显示在肺组织和AECⅡ中,miR-365-3p在BPD组中的表达水平高于同日龄对照组中的表达。通过miRNAs qRT-PCR验证过表达miR-365-3p的效率,过表达效率显著。转染miR-365-3p后细胞形态学观察可见control组和NC组细胞为上皮样细胞形态,细胞具有明显的极性,细胞与细胞之间紧密连接,miR-365-3p组细胞之间连接松散,间隙变大并有明显的丝状伪足形成,呈现出成纤维细胞样改变。Western blot显示转染miR365-3p mimics后,N-cad蛋白表达增高,E-cad蛋白表达下降。qRT-PCR显示转染miR365-3p mimics后,N-cad mRNA表达增高,E-cad mRNA表达下降。Western blot显示转染miR365-3p mimics后BMP7、p-smad2/3、smad2/3蛋白表达较对照组均下降。qRT-PCR显示转染miR365-3p mimics后BMP7、smad2、smad3 mRNA表达较对照组和NC组均下降。双荧光素酶报告基因检测结果显示共转染BMP7-wt和miR-365-3p mimics能引起293T工具细胞荧光素酶活性显著下降,miR-365-3p能与BMP7的结合。结论:1、以往研究已证实在BPD肺组织中,BMP7表达增高,且随时间延长逐渐下降。本研究发现在Ⅱ型肺泡上皮细胞中,BMP7表达变化发生的时间与组织同步,并且其下游信号转导蛋白smad2/3出现转运活化,表明该通路在BPD的发生中发挥作用。2、体外实验证实,EGF诱导肺上皮细胞后,BMP7通过活化信号转导蛋白smad2/3抑制肺泡上皮细胞转分化,此发现为临床应用提供新途径。3、分别在组织水平和细胞水平验证miRNA-365-3p在BPD中高表达。miR-365-3p能够靶向结合BMP7,下调BMP7及减少下游信号转导蛋白smad2/3活化,是肺上皮细胞向间质转分化的重要机制,为未来BPD的防治提供新途径。