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子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一,在全球范围内,是女性第六大常见癌症。随着人口平均寿命的增长和生活习惯的改变,近二十年来,EC的发病率呈现持续上升和年轻化趋势。在我国,EC是仅次于宫颈癌的第二个常见的妇科恶性肿瘤,约占妇科恶性肿瘤的20-30%,在部分发达城市,EC的发病率已经超过宫颈癌,位于女性生殖道恶性肿瘤的首位。EC的病因目前尚不完全明确,主要的高危因素包括遗传因素、肥胖、糖尿病、高血压、雌激素用药史、多囊卵巢综合征等,传统观点根据流行病学特征和组织学特征,认为EC有两种发病类型,即Ⅰ型(雌激素依赖型)和Ⅱ型(非雌激素依赖型),其中Ⅰ型肿瘤占大多数(85-90%),其特点是分级低,预后相对良好。但这一传统分型并不能准确的反应EC的生物学行为,根据TCGA基因组的数据,研究人员将EC分为POLE突变型、微卫星不稳定型(MSI)、低拷贝型(CN-low)和高拷贝型(CN-high),前三种分型预后较好,而最后一种预后最差。因此对于EC发生、发展机制,仍有许多问题值得探索。近年来,小分子RNA(microRNA,miRNA)越来越成为研究的重点,很多研究表明miRNA对细胞增殖、有丝分裂、凋亡和分化等过程有重要影响。目前已经证实在EC中有多种miRNA表达异常,比如miR-182的上调,miR-152的下调等。MiR-206作为miRNA家族中重要的一员,在包括肺癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌瘤和骨肉瘤等在内的多种人类恶性肿瘤中表达异常,其作用涉及到肿瘤发生、发展及转移的各个方面。然而miR-206是否参与到EC的发生发展目前尚未见研究报道。通过生物信息学分析的方法,我们预测出组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)是miR-206潜在的靶基因之一。HDAC6属于Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶,与该家族其他亚型不同的是,HDAC6拥有多种组蛋白以外的蛋白底物,并且它的作用位置主要在细胞质,其能调节蛋白质的运输和降解,进而影响细胞的形状和迁移。已有文献证明,HDAC6参与调控AKT、Wnt等信号通路,影响包括卵巢癌和乳腺癌在内的多种人类癌症的形成及转移,因此,其是否参与调控EC的发生发展值得探索。第一部分子宫内膜癌中miR-206及其靶基因HDAC6的表达及相关性研究研究目的:1.筛选EC组织中差异表达的miRNAs,生物信息学分析寻找潜在的调控基因;2.验证miR-206及HDAC6在EC细胞及临床样本中的表达差异;3.探索miR-206及HDAC6表达水平与临床特征的相关性;4.研究HDAC6的表达水平与EC预后的关系。研究方法:1.通过公共数据库(BCGSC)中的miRNA芯片,寻找EC组织和癌旁对照中差异表达的miRNAs;2.通过TargetScan等算法预测miR-206的靶基因;3.利用TCGA数据库探索HDAC6的表达与EC预后及分期的关系;4.通过qRT-PCR实验及Western blot实验验证EC组织及细胞(HEC-1-A,Ishikawa,AN3C,RL95)中miR-206、HDAC6的表达,通过免疫组化实验检测EC组织中HDAC6的定位及表达。研究结果:1.公共数据库miRNA表达谱差异分析显示,相对于正常组织,EC组织中共有159个差异显著miRNA,其中72个下调miRNA,87个上调miRNA。miR-206位列其中;2.通过生物信息学预测的方法,利用TargetScan、miRanda等网站预测出HDA C6为miR-206潜在的靶基因;3.qRT-PCR实验显示,相对于癌旁对照,miR-206在EC组织中低表达(n=46,尸<0.001);在四种EC细胞中,miR-206的表达与子宫内膜基质细胞相比也明显下调(P<0.001);4.qRT-PCR及Western blot实验显示,HDAC6在EC组织中的表达高于癌旁对照(n=46,P<0.001,P<0.01),在四种EC细胞中,HDAC6的表达与子宫内膜基质细胞相比也明显上调(P<0.001,P<0.01);5.应用Spearman相关性检验,46对EC组织中miR-206和HDAC6 mRNA表达显著负相关(P=0.0032);6.TCGA数据库中相关数据显示,与正常子宫内膜组织相比,StageⅢ期患者癌组织中HDAC6表达显著增高(P=0.04);HDAC6过表达组(n=423)的预后显著更差(P=0.0024);7.免疫组化实验显示HDAC6主要定位于肿瘤细胞的细胞质,其表达量与病理分级相关,低分化患者较高分化患者HDAC6染色评分更高。研究结论:1.HDAC6是miR-206潜在的靶基因;可能抑制HDAC6的表达;2.miR-206在EC组织中显著低表达;HDAC6高表达可能与EC患者不良预后相关。第二部分 miR-206及HDAC6对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭的影响及其相关机制的研究研究目的:1.验证miR-206与HDAC6之间的直接调控关系;2.研究miR-206-HDAC6调控轴对EC细胞迁移、侵袭、增殖等生物学行为的影响;3.探索miR-206-HDAC6调控轴影响EC的相关机制。研究方法:1.通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-206对HDAC6的直接调控关系;2.通过慢病毒转染高分化EC细胞株Ishikawa,构建miR-206过表达/低表达、HDAC6过表达/低表达、miR-206及HDAC6同时低表达及miR-206及HDAC6同时过表达的 9 种稳转细胞系:IshikawamiR206-NC,IshikawamiR206-,IshikawamiR206+,IshikawasiHDAC6,IshikawasiHDAC6-NC,IshikawaHDAC6+,Ishikawa HDAC6+_NC,Ishikawa miR206-/siHDAC6,IshikawamiR206-/siHDAC6,相同方法转染低分化 EC 细胞株 AN3C,然后利用qRT-PCR及Western blot确认转染效率。;3.通过CCK-8实验及平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;通过细胞划痕实验检测细胞水平迁移能力;通过Transwell实验检测细胞迁移和浸润的能力;通过Western blot实验检测HDAC6表达情况及各种信号通路蛋白的活化情况;4.通过二代测序技术,寻找miR-206异常表达之后产生的差异基因,绘制热图并进行KEGG通路富集分析。研究结果:1.miR-206调控EC细胞的生物学功能(1)qRT-PCR 实验发现,与 IshikawamiR206_NC相比,IshikawamiR206-中 miRNA-206表达明显降低,而IshikawamiR206+中miRNA-206表达明显升高,证明细胞系构建成功,在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;(2)CCK8实验与平板克隆形成实验显示,与IshikawamiR206_NC相比,Ishikawa miR206-细胞增殖能力增强,而IshikawamiR206+细胞增殖能力明显减弱,在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;(3)划痕实验与 Transwell实验显示,与 IshikawamiR206_NC相比,IshikawamiR206-细胞侵袭、迁移及浸润能力显著增强,而IshikawamiR206+细胞的侵袭、迁移及浸润能力则减弱,在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;2.应用二代测序技术,筛选出 AN3CmiR206_NC(n=1),AN3CmiR206-(n=2)与AN3CmiR206+(n=2)细胞中差异表达的基因25个,其中癌基因12个,抑癌基因13个,大多数都是已知的miR-206靶基因,其中包括HDAC6。富集分析显示差异基因集中分布在IL-17、AKT等通路;3.在Ishikawa细胞中共转染miR-206 mimics及野生型3’UTR-HDAC6质粒,荧光素酶活性显著降低(P=0.006),而共转染miR-206 mimics及突变型3’UTR-HDAC6质粒时,相对荧光素酶活性没有显著变化。双荧光素酶报告基因实验显示miR-206能直接结合在HDAC6的3’-非编码区,从而在转录后水平调控HDAC6的表达。4.HDAC6活化影响EC细胞的生物学功能(1)qRT-PCR 实验显示,与 IshikawasiHDAC6_NC相比,Ishikawa siHDAC6 中HDAC6表达明显降低(P<0.0001),而与 Ishikawa HDAC6+-NC 相比,IshikawaHDAC6+中HDA C6表达明显升高(P<0.0001)。通过Western blot在蛋白水平验证,也得到相同的结果。在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;(2)CCK8实验与平板克隆实验显示,与IshikawaHDAC6+_NC相比,IshikawaHDAC6+细胞增殖能力增强,与 IshikawasiHDAC6_NC相比,IshikawasiHDAC6细胞增殖能力明显减弱;在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;(3)划痕实验与Transwell实验显示,与IshikawaHDAC6+_NC相比,IshikawaHDAC6+细胞侵袭、迁移及浸润能力显著增强,与IshikawasiHDAC6_NC相比,IshikawasiHDAC6细胞侵袭、迁移及浸润能力则减弱,在AN3C细胞系中也获得了类似的结果;5.miR-206调控细胞功能依赖于HDAC6的活化:(1)Western blot实验发现,与IshikawamiR206+相比,IhsikawamiR2060+/HDAC6+中HDAC6的表达明显升高(P<0.01);CCK-8实验显示过表达HDAC6可以部分逆转miR-206过表达引起的细胞增殖能力降低(P<0.01);划痕实验和Transwell实验显示过表达HDAC6可以部分逆转miR-206过表达引起的细胞迁移和侵袭能力降低;(2)Western blot实验发现,与IshikawamiR206-相比,IshikawamiR206-/siHDAC6中HDAC6的表达明显降低(P<0.01);CCK-8实验显示低表达HDAC6可以部分逆转miR-206低表达引起的细胞增殖能力增强(P<0.01);划痕实验和Transwell实验显示低表达HDAC6可以部分逆转miR-206低表达引起的细胞迁移和侵袭能力增强;6.通过Western blot实验发现,在HDAC6低表达的细胞系中,PTEN的表达升高,而p-AKT和p-mTOR的表达降低;而在HDAC6过表达的细胞系中,PTEN的表达降低,而p-AKT和p-mTOR的表达升高。miR-206-HDAC6轴调控EC细胞生物学功能可能与PTEN/AKT/mTOR通路相关。研究结论:1.miR-206可能通过靶向HDAC6调控PTEN/AKT/mTOR通路来抑制EC细胞增殖、迁移和侵袭;2.miR-206和HDAC6可能在EC的发生发展中起到一定的作用。